HL-60白血病細(xì)胞內(nèi)Nucleostemin下調(diào)對(duì)PI3K-AKT-mTOR通路相關(guān)基因的影響.pdf

1、目的:
　　采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)p53缺失型白血病細(xì)胞HL-60中核干細(xì)胞因子(Nucleostemin，NS)的表達(dá)，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR通路中相關(guān)基因的變化情況，研究NS與PI3K/AKT/mTOR通路之間的相關(guān)性;查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)Ras/Raf/Mek/Erk通路及一些生長(zhǎng)因子類(lèi)與PI3K/AKT/mTOR通路的激活密切相關(guān)，通過(guò)對(duì)Ras/Raf/Mek/Erk通路及一些生長(zhǎng)因子類(lèi)基因的

2、變化進(jìn)行檢測(cè)，初步探索NS下調(diào)后導(dǎo)致PI3K/AKT/mTOR變化的可能原因，為完善NS非依賴(lài)p53通路的作用機(jī)制提供依據(jù)。
　　方法:
　　(1)以p53野生型K562細(xì)胞和p53突變型NB4細(xì)胞為對(duì)照，普通PCR法檢測(cè)p53基因在HL-60細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　(2)將慢病毒表達(dá)載體NS-siRNA-GV248與其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行病毒的包裝及滴度測(cè)定。
　　(3)根據(jù)HL

3、-60細(xì)胞的MOI值及病毒滴度，將慢病毒轉(zhuǎn)染至HL-60細(xì)胞中以下調(diào)NS的表達(dá)，倒置熒光顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率，Real-time PCR和Western blot檢測(cè)NS在基因和蛋白水平上的敲減情況。
　　(4)Real-timePCR檢測(cè)HL-60細(xì)胞中NS表達(dá)下調(diào)前后PI3K/AKT/mTOR和Ras/Raf/Mek/Erk通路中的相關(guān)基因，以及GrB2、STAT5、NFκB、TGFβ基因的表達(dá)情況
　　(5)采用SPSS

4、15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示。多組樣本間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法，校正檢驗(yàn)水平α'=0.0167;兩組樣本間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)普通PCR結(jié)果顯示，K562和NB4細(xì)胞中有p53表達(dá)，而HL-60細(xì)胞中不表達(dá)p53。
　　(2)針對(duì)NS基因下調(diào)的慢病毒表達(dá)載體NS-RNAi-GV24

5、8轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行包裝、濃縮，檢測(cè)病毒滴度為2×108TU/ml。
　　(3)倒置熒光顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率達(dá)80％以上;Real-timePCR檢測(cè)陰性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間NS基因mRNA抑制率為56.5％;Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示:無(wú)論是處于低MOI值還是高M(jìn)OI值，NS蛋白表達(dá)量均出現(xiàn)明顯下調(diào)。
　　(4)Real-timePCR結(jié)果顯示:NS表達(dá)下調(diào)后PI3K/AKT/mTOR和Ras/Raf/Mek/E

6、rk通路中的相關(guān)基因，以及GrB2、STAT5、NFκB、TGFβ的mRNA表達(dá)量均減低，與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　(1)PI3K/AKT/mTOR通路和Ras/Raf/MekErk通路相關(guān)基因，以及GrB2、STAT5、NFκB及TGFB基因的表達(dá)與NS基因表達(dá)下調(diào)呈正相關(guān)。
　　(2)NS非依賴(lài)p53作用過(guò)程可能與PI3K/AKT/mTOR通路、Ras/Raf/MekErk通路及GrB2、ST