雷帕霉素對HL-60細(xì)胞內(nèi)PI3K-Akt-mTOR通路下游蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的:急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是一種血液系統(tǒng)的惡性疾病，起源于造血干細(xì)胞克隆性異常增殖，是急性髓系白血病中的一種特殊類型，其中15號染色體的PML基因和17號染色體RARa基因易位，形成特征性細(xì)胞遺傳學(xué)異常t(15;17)(q22，q21)，出現(xiàn)PML-RARa(promyelocytic leukemia/retinoic acid receptor alpha)融合基因

2、。并證明了早幼粒細(xì)胞白血病/維甲酸受體融合基因是急性早幼粒細(xì)胞白血病發(fā)病的分子基礎(chǔ)，該融合基因編碼的融合蛋白具備一定的酪氨酸激酶活性，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號通路可被進(jìn)一步異常激活，從而具有促進(jìn)細(xì)胞異常增殖及使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抗凋亡特性[1-4]。目前急性早幼粒細(xì)胞白血病在臨床上基本是可以治愈的疾病，其是應(yīng)用維甲酸(ATRA)和亞砷酸(ATO)來誘導(dǎo)分化治療，可以取得80％-90％的完全緩解率，但是維甲酸的應(yīng)用易發(fā)生維甲酸綜合征，長期應(yīng)用可發(fā)生耐藥，并

3、且部分復(fù)雜和難治性患者不能誘導(dǎo)緩解或緩解后易復(fù)發(fā)。
　　雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)屬于大環(huán)內(nèi)酯類，本質(zhì)是一種抗生素，為mTOR通路抑制劑。雷帕霉素作為免疫抑制劑，通過阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制免疫細(xì)胞的生長和增殖，抑制IL-2及其他免疫分子的合成來發(fā)揮免疫抑制作用，同時抑制移植患者IgG的產(chǎn)生和供著特異性免疫的發(fā)生[5-7]。因其具有強的免疫抑制已被FDA批準(zhǔn)用于器官移植的抗排斥反應(yīng)。相對于傳統(tǒng)的免疫抑制劑，雷帕霉素具有用量

4、小，效率高，毒副作用小尤其是腎毒性小。其在風(fēng)濕免疫系統(tǒng)性疾病、器官移植術(shù)后降低免疫排斥反應(yīng)以及對腎臟功能的修復(fù)等多類疾病治療中均具有顯著的效果。研究顯示雷帕霉素不僅具有免疫抑制作用，還具有抗腫瘤的雙重作用。其主要是通過抑制mTOR信號通路來抑制細(xì)胞內(nèi)周期的轉(zhuǎn)換，抑制細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制，使細(xì)胞不能進(jìn)行正常的有絲分裂，雷帕霉素可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制新生血管生成、腫瘤侵襲和抑制血管內(nèi)皮增殖來發(fā)揮其抗腫瘤作用[8-13]，而且在實驗研究中得到

5、證實。目前，在臨床上雷帕霉素已經(jīng)應(yīng)用于某些實體腫瘤的治療，并且取得一定的療效，實驗證實雷帕霉素主要是通過抑制mTOR信號通路發(fā)揮作用，目前越來越多研究白血病的發(fā)生與信號通路的過度激活有關(guān)，因此雷帕霉素在治療造血系統(tǒng)惡性腫瘤方面的作用也正在被越來越多的人關(guān)注和研究。
　　目前在臨床上，維甲酸和三氧化二砷成為治療急性早幼粒細(xì)胞白血病一線藥物，治療效果顯著，但仍存在一些問題，部分患者發(fā)生耐藥的情況也越來越明顯。PML-RARa融合蛋白的

6、形成是急性早幼粒細(xì)胞白血病的發(fā)病基礎(chǔ)，具有一定的酪氨酸激酶活性，從而使細(xì)胞分化發(fā)生阻滯，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此靶向降解該融合蛋白，恢復(fù)原有基因的功能，使阻滯細(xì)胞分化成熟，這是治療藥物機制。但是，一旦患者出現(xiàn)過度增強的酪氨酸激酶活性，出現(xiàn)多藥耐藥基因的過度表達(dá)，白血病細(xì)胞的抗凋亡能力就會提高，降低了患者對化療藥物的反應(yīng)，從而患者發(fā)生耐藥。多項研究表明患者出現(xiàn)耐藥很可能是多種發(fā)生機制的聯(lián)合結(jié)果，整體過程復(fù)雜，其具體機制需要進(jìn)一步研究。針對

7、耐藥的急性早幼粒細(xì)胞白血病患者，我們可以嘗試研究其他新的化療藥物，為復(fù)發(fā)難治患者的治療帶來新的希望?，F(xiàn)在多項研究表明急性早幼粒細(xì)胞白血病中的磷脂酰肌醇3激酶(phosp-hatidylinositol3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(targetof rapamycin，mTOR)信號通路存在異常激活，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和耐藥性上起重要作用。本實驗是在長期研究白血病中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用機制的基礎(chǔ)上，

8、探討mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素是否通過抑制mTOR靶點的活性來抑制早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株的生長，探究其作用于急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞后，對其生長增殖，凋亡和該通路下游基因與蛋白表達(dá)的生物學(xué)影響，為臨床上急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療探索新的方法和策略。
　　方法:
　　1、MTT方法檢測不同濃度的雷帕霉素對HL-60細(xì)胞增殖的影響。
　　2、NADH細(xì)胞染色方法檢測不同濃度的雷帕霉素對HL-60細(xì)胞內(nèi)線

9、粒體的影響，間接反應(yīng)細(xì)胞凋亡情況。
　　3、RT-PCR檢測不同濃度雷帕霉素對HL-60細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路下游mRNA的影響。
　　4、Western Blot法檢測不同濃度的雷帕霉素對HL-60細(xì)胞PI3K/Akt/ mTOR通路下游蛋白水平上表達(dá)的影響。
　　5、統(tǒng)計學(xué)方法處理。
　　結(jié)果:
　　1、不同濃度的雷帕霉素對HL-60細(xì)胞增殖情況的影響
　　用不同濃度的雷帕霉素作用于對

10、數(shù)期的HL-60細(xì)胞，24h后，應(yīng)用MTT方法（CCK-8試劑處理）檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠抑制HL-60細(xì)胞的增殖，20、40、80、160、320、640 nmol/L雷帕霉素處理組HL-60細(xì)胞的抑制率均明顯高于空白對照組(P＜0.05)，并且呈濃度依賴性。在此濃度范圍內(nèi)，隨著雷帕霉素濃度的升高，HL-60細(xì)胞存活率會逐漸降低。而5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L濃度雷帕霉素作用組對HL-60細(xì)胞存活率無顯著影響

11、（P＞0.05），分析后IC50為211.9nmol/L。
　　2、不同濃度的雷帕霉素對HL-60細(xì)胞內(nèi)線粒體的影響
　　用不同濃度的雷帕霉素作用于HL-60細(xì)胞24h后，通過NADH細(xì)胞染色后發(fā)現(xiàn)，40、80nmol/L處理組HL-60細(xì)胞與空白對照組相比，細(xì)胞整體成團(tuán)趨勢減小，細(xì)胞內(nèi)線粒體由月牙形變?yōu)槌蓤F(tuán)塊或斑塊分布，局部顆粒變淺，且胞膜及核膜由開始的光滑完整出現(xiàn)皺縮裂口，甚至出現(xiàn)細(xì)胞的崩解，并且隨濃度的增高，這些現(xiàn)象越

12、明顯。
　　3、雷帕霉素對HL-60細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR下游因子mRNA表達(dá)的影響
　　用不同濃度的雷帕霉素，40nmol/L，80nmol/L，160nmol/L處理HL-60細(xì)胞24小時后，應(yīng)用實時熒光定量PCR處理后結(jié)果表明，翻譯起始因子e1F4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)，核糖體40S小亞基S6K蛋白激酶P70S6K，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，缺氧誘導(dǎo)因子-a(HIF-a)基因表達(dá)水平均明顯低于空白對

13、照組基因的表達(dá)量(P＜0.05)，而且呈濃度依耐性，隨著雷帕霉素濃度增高，mRNA表達(dá)量逐漸降低(P＜0.05)。
　　4、雷帕霉素對HL-60細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR下游因子蛋白的影響
　　用不同濃度雷帕霉素處理HL-60細(xì)胞24小時后，濃度分別為40nmol/L，80nmol/L，160nmol/L。Western blot實驗結(jié)果顯示，藥物處理組與空白對照組相比HL-60細(xì)胞內(nèi)mTOR下游因子4E-BP1，VE

14、GF, HIF-a蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)，而且藥物處理組隨著雷帕霉素濃度的增加，相關(guān)蛋白的表達(dá)量逐漸降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1、在一定濃度范圍內(nèi)，雷帕霉素可有效提高對HL-60細(xì)胞的抑制率，并且呈濃度依賴性，濃度越高，抑制細(xì)胞增殖的能力越強。同時，雷帕霉素在一定濃度范圍內(nèi)可以減少線粒體的數(shù)量及影響其質(zhì)量，使細(xì)胞崩解，促進(jìn)HL-60細(xì)胞的凋亡。
　　2、雷帕霉素在一定濃度范圍內(nèi)能夠使HL-60細(xì)胞內(nèi)P