雷帕霉素聯(lián)合伊馬替尼對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)SHIP基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的:慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)為多能造血干細(xì)胞惡性增殖性疾病，是慢性白血病中常見的一種類型，9號(hào)和22號(hào)染色體易位，形成BCR-ABL融合基因，導(dǎo)致酪氨酸激酶活性增加，這是慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)病機(jī)制[1-2]。傳統(tǒng)治療藥物羥基脲、沙利度胺、干擾素等雖然在一定時(shí)期內(nèi)可以改善患者癥狀，但不能治愈本病，也不能從根源上阻斷疾病進(jìn)展。絕大多數(shù)患者在經(jīng)過一段時(shí)期的慢性期后，進(jìn)入加速期或急變期，最終因感染或骨髓衰竭等并發(fā)癥而死亡。
　　

2、伊馬替尼是一種酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)，它對(duì)Bcr-abl激酶升高的白血病細(xì)胞有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用，目前已經(jīng)作為治療慢性粒細(xì)胞白血病的一線藥物應(yīng)用于臨床。但在臨床中發(fā)現(xiàn)，雖然伊馬替尼對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病慢性期有很好的治療效果，很多患者可以實(shí)現(xiàn)Bcr-abl基因和費(fèi)城染色體的轉(zhuǎn)陰，但仍有部分患者出現(xiàn)耐藥。研究證實(shí)Bcr/Abl激酶可以激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，影響細(xì)胞周期分布以及

3、細(xì)胞凋亡等，導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)病。其中，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路在慢性粒細(xì)胞白血病對(duì)TKIs耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用，抑制mTOR信號(hào)通路的異常激活有可能增強(qiáng)Bcr/Abl激酶陽性細(xì)胞對(duì)TKIs的敏感性。雷帕霉素是mTOR途徑抑制劑，人們發(fā)現(xiàn)其具有免疫抑制和抗腫瘤的雙重功效，并且在臨床上也已經(jīng)應(yīng)用于某些實(shí)體腫瘤的治療，由此其在治療造血系統(tǒng)惡性腫瘤方面的作用也正在被越來越多的人關(guān)注和研究。
　　 本課題組在長(zhǎng)期從事白血

4、病中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用機(jī)制的研究基礎(chǔ)上，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)BCR-ABL融合基因存在時(shí)，SHIP基因的表達(dá)受到抑制，提示SHIP基因缺失或功能受抑是慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。
　　 目前臨床應(yīng)用伊馬替尼作為治療慢性粒細(xì)胞白血病的一線用藥，其療效顯著，但患者發(fā)生耐藥的問題也不容忽視。慢性粒細(xì)胞性白血病的發(fā)病機(jī)制是融合基因BCR-ABL編碼的P210蛋白的酪氨酸激酶被異常激活，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此一旦酪氨酸激酶蛋白濃度增加，細(xì)胞便會(huì)被

5、重新激活過度增生，患者發(fā)生耐藥。多種研究表明患者對(duì)伊馬替尼發(fā)生耐藥是多種機(jī)制的綜合結(jié)果，且過程復(fù)雜，其具體機(jī)制也有待研究。針對(duì)其耐藥的發(fā)生，我們可以聯(lián)合傳統(tǒng)的化療藥物，也可以聯(lián)合其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑來發(fā)揮協(xié)同治療作用。
　　 研究表明PI3K/AKT/mTOR途徑是BCR/ABL融合基因下游的一條重要通路[3]，本實(shí)驗(yàn)擬在探討雷帕霉素是否可以通過抑mTOR靶點(diǎn)的活性從而抑制白血病細(xì)胞株的生長(zhǎng)，探討mTOR通路抑制劑雷帕霉素對(duì)慢性粒

6、細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞生長(zhǎng)增殖與凋亡的生物學(xué)影響及K562細(xì)胞中SHIP基因表達(dá)情況，探討mTOR通路抑制劑雷帕霉素與酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼在慢性粒細(xì)胞性白血病的治療中是否存在協(xié)同作用，為臨床治療慢性粒細(xì)胞白血病探索新的方法和策略。
　　 方法:
　　 1、MTT法檢測(cè)不同濃度的雷帕霉素和伊馬替尼單藥及不同濃度伊馬替尼聯(lián)合單一濃度雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響。
　　 2、流式細(xì)胞分析法檢測(cè)不同濃度的雷

7、帕霉素和伊馬替尼單藥及二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響。
　　 3、WesternBlot法檢測(cè)SHIP基因在蛋白水平上的表達(dá)。
　　 4、RT-PCR檢測(cè)各組K562細(xì)胞SHIPmRNA表達(dá)變化。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)果:
　　 1、雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　 不同濃度的雷帕霉素作用于K562細(xì)胞24h后，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素抑制K562細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性

8、，25、50、100、200、500、1000nmol/L處理組K562細(xì)胞存活率均明顯低于溶劑對(duì)照組(P＜0.05)。在25～1000nmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著雷帕霉素濃度的升高K562細(xì)胞存活率均明顯降低。而1、6.25、12.5nmol/L濃度雷帕霉素處理組對(duì)K562細(xì)胞存活率無明顯影響(P＞0.05)，其IC50為186.7nmol/L。
　　 雷帕霉素處理24h后，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡，表現(xiàn)為胞膜

9、完整，核固縮或核碎裂，可見凋亡小體。流式細(xì)胞分析顯示，處理組G0/G1期細(xì)胞比對(duì)照組顯著增多，而S期細(xì)胞比例則明顯降低(P＜0.05)。提示雷帕霉素可顯著影響K562細(xì)胞周期分布，誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯。
　　 2、伊馬替尼抑制K562細(xì)胞增殖誘導(dǎo)其凋亡
　　 不同濃度的伊馬替尼作用于K562細(xì)胞24h后，發(fā)現(xiàn)伊馬替尼抑制K562細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性，200、500、1000、2000nmol/L處理組K562細(xì)胞

10、存活率均明顯低于溶劑對(duì)照組(P＜0.05)。在200～2000nmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著伊馬替尼濃度的升高K562細(xì)胞存活率均明顯降低。
　　 3、雷帕霉素能增強(qiáng)伊馬替尼對(duì)K562細(xì)胞的促凋亡作用
　　 選擇低于IC50劑量的50nmol/L的雷帕霉素和不同濃度伊馬替尼聯(lián)合作用于K562細(xì)胞，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與兩單藥組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05），說明雷帕霉素和伊馬替尼聯(lián)合作用在K562細(xì)胞上時(shí)，可產(chǎn)生

11、增強(qiáng)效應(yīng)。
　　 4、雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)mTOR表達(dá)的影響
　　 mTOR蛋白分子量為289kD，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，空白對(duì)照組、藥物處理組均在289kD位置出現(xiàn)熒光條帶。設(shè)定GAPDH為內(nèi)參基因，定量分析熒光條帶，結(jié)果表明，雷帕霉素處理后對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)mTOR蛋白的表達(dá)無明顯影響(P＞0.05)，但對(duì)降低K562細(xì)胞內(nèi)mTOR蛋白磷酸化水平的效果明顯(P＜0.05)。
　　 5、雷帕霉素對(duì)K

12、562細(xì)胞內(nèi)SHIP基因蛋白的影響
　　 Western結(jié)果顯示，白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞內(nèi)SHIP蛋白無表達(dá)，經(jīng)雷帕霉素處理后K562細(xì)胞內(nèi)表達(dá)SHIP蛋白，且呈現(xiàn)濃度依賴性，隨著雷帕霉素濃度的增加，蛋白表達(dá)增加。
　　 6、雷帕霉素對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)SHIP基因表達(dá)的影響
　　 RT-PCR結(jié)果顯示不同濃度的雷帕霉素作用K562細(xì)胞24h，SHIP基因表達(dá)水平均比對(duì)照組表達(dá)量增高(P＜0.05)，且隨著雷帕霉素

13、濃度的增加而表達(dá)量增加。
　　 7、伊馬替尼對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)SHIP基因表達(dá)的影響
　　 RT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度的伊馬替尼作用于K562細(xì)胞24h后，SHIP基因表達(dá)水平均比對(duì)照組表達(dá)量增高(P＜0.05)，且隨著伊馬替尼濃度的增加而表達(dá)量增加。
　　 8、雷帕霉素聯(lián)合伊馬替尼對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)SHIP基因表達(dá)的影響
　　 RT-PCR結(jié)果顯示兩藥聯(lián)合作用于K562細(xì)胞24h，SHIP基因表達(dá)量均較

14、單藥作用后表達(dá)量高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、雷帕霉素在一定濃度范圍內(nèi)能有效抑制K562細(xì)胞增殖，并呈濃度依賴性，并促進(jìn)其凋亡，并使K562細(xì)胞內(nèi)SHIP基因表達(dá)量增高，提示雷帕霉素可抑制慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖。
　　 2、伊馬替尼在一定濃度范圍內(nèi)能有效抑制K562細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，并使K562細(xì)胞內(nèi)SHIP基因的表達(dá)水平上升。
　　 3、雷帕霉素聯(lián)合伊馬替尼在抑制K56細(xì)胞增殖，