t-PA通過(guò)ERK和P38途徑調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分VEGF165和t-PA雙基因共表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建由pIRES載體介導(dǎo)的攜帶育血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因(VEGF165)及組織型纖溶酶原激活物基因(t-PA)的雙基因共表達(dá)載體，為聯(lián)合上述兩種基因共表達(dá)治療下肢深靜脈血栓形成提供載體基礎(chǔ)。
　　 方法：①設(shè)計(jì)引物后，ECV304細(xì)胞提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)得到目的基因的cDNA，經(jīng)PCR得到目的基因擴(kuò)增片段；②將

2、VEGF165基因全長(zhǎng)序列克隆至pMD10-Tsimple載體，構(gòu)建p-MD19-T-VEGF165KpnI/EcoRI，并通過(guò)PCR、酶切和測(cè)序方法加以鑒定；③采用KpnI和EcoRI分步酶切法，分別酶切pMD19-T-VEGFKpnII/EcoRl重組質(zhì)粒反pIRES載缽，圓收目的片段，構(gòu)建VEGF165單基因表達(dá)載體pVEGF165-IRES;④t-PA基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化，與pMD19-Tsimpl載體連接，用Xb

3、aI和NotI雙酶切、測(cè)序加以鑒定；⑤用XbaI和Notl分別酶切pMDl9-T-t-PAXbalI/Notl及pVEGF165重組載體，并分別回收t-PA基因目的片段和pVEGF165-IRES載體片段，構(gòu)建pVEGF165-IRES-t-PA雙基因真核共表達(dá)載體。
　　 結(jié)果：①成功從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304細(xì)胞中克隆出VEGF165和t-PA基因；②成功構(gòu)建pVEGF165-IRES-t-PA雙基因真核共表達(dá)載體；③

4、體外轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞后，t-PA基因的蛋白表達(dá)量較VEGF165基因的蛋白表達(dá)量低(30.6％)，未達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)期目的。
　　 結(jié)論：由IRES介導(dǎo)的雙基因表達(dá)載體的下游基因表達(dá)量較低，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)是不等量的，需進(jìn)一步探討提高下游基因的表達(dá)量并延長(zhǎng)其表達(dá)時(shí)間的有效方法以增強(qiáng)其治療效應(yīng)。
　　 第二部分t-PA通過(guò)ERK和P38途徑調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)
　　 實(shí)驗(yàn)一人t-PA腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建<

5、br>　　 目的：構(gòu)建攜帶組織型纖溶酶原激活物(t-PA)的重組腺病毒(Adt-PA)。
　　 方法：t-PA基因克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV中，構(gòu)建成pAdtrack-CMV-t-PA。pAdtrack-CMV-t-PA線性化后轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)菌中，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)同源重組。線性化重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞．包裝成重組腺病毒顆粒Adt-PA。擴(kuò)增重組腺病毒載體

6、，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定及病毒PCR鑒定。
　　 結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定及病毒PCR鑒定和綠色熒光觀察，證實(shí)成功構(gòu)建了攜帶t-PA的重組腺病毒Adt-PA。經(jīng)過(guò)兩輪擴(kuò)增后，病毒滴度可以達(dá)到2.56×109pfu/ml，該病毒滴度已能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了Adt-PA，病毒經(jīng)擴(kuò)增、純化后滴度達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　　 實(shí)驗(yàn)二t-PA影響VEGF表達(dá)的研究
　　

7、目的：檢測(cè)轉(zhuǎn)染了重組腺病毒(Adt-PA)的ECV304細(xì)胞中VEGFmRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，以評(píng)估t-PA對(duì)ECV304細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響。
　　 方法：取生長(zhǎng)活躍的ECV304細(xì)胞，轉(zhuǎn)染不同病毒滴度t-PA，轉(zhuǎn)染比率（細(xì)胞：病毒）分別為l:10、1:50、1:100，觀察細(xì)胞增殖情況，選取合適MOI值；將Adt-PA轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞后使用Westemblot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)t-PA蛋白的表達(dá)；然后將ECV304細(xì)胞

8、分為2組，分別在培養(yǎng)液中加入Adt-PA作為治療組及空病毒Ad作為對(duì)照組，混合培養(yǎng)后選取24h和48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)分析ECV304細(xì)胞中VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，Westemblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ECV304細(xì)胞中VEGF蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：當(dāng)MOI為1:50時(shí)對(duì)ECV304細(xì)胞增殖具有一定的促進(jìn)作用；而1：100時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響明顯；Adt-PA轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞后在72h內(nèi)隨著時(shí)間的

9、延長(zhǎng)其蛋白表達(dá)量也逐漸升高；ECV304細(xì)胞被Adt-PA轉(zhuǎn)染后，其細(xì)胞內(nèi)VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄水平和VEGF蛋白的表達(dá)量在24h和48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)較對(duì)照組均有明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 結(jié)論：外源性t-PA可顯著增加ECV304細(xì)胞中VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。
　　 實(shí)驗(yàn)三t-PA影響VEGF表達(dá)的相關(guān)信號(hào)通路研究
　　 目的：研究外源性t-PA增加ECV304細(xì)胞中VEGFmR

10、NA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平過(guò)程中可能涉及的信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　 方法：將培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞分為空病毒轉(zhuǎn)染組(Ad)和轉(zhuǎn)基因組(Adt-PA)，在兩組細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入Adt-PA和Ad后共同培養(yǎng)，Westernblot檢測(cè)2組Oh、24h、48h和72hERK/P38/JNK磷酸化水平；為證明ERK信號(hào)通路在介導(dǎo)t-PA上調(diào)ECV304細(xì)胞VEGF表達(dá)過(guò)程中的作用，我們應(yīng)用該通路的特異性阻斷劑PD98059(PD)干預(yù)信號(hào)傳導(dǎo)

11、，以觀察VEGF的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)分組如下：空病毒組(Ad)、PD組、Adt-PA組和Adt-PA+PD組，Westemblot檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)水平及ERK的磷酸化水平；為證明P38信號(hào)通路在介導(dǎo)t-PA上調(diào)ECV304細(xì)胞VEGF表達(dá)過(guò)程中的作用，我們?cè)賾?yīng)用該通路的特異性阻斷劑SB203580(SB)干預(yù)信號(hào)傳導(dǎo)，以觀察VEGF的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)分組同上，Westemblot檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)水平及P38的磷酸化水平；分別以PD和S

12、B作用于ECV304細(xì)胞并采用Westemblot方法檢測(cè)ERK和P38磷酸化水平變化以辨明ERK和P38信號(hào)通路的上下游關(guān)系。
　　 結(jié)果：Adt-PA轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞后可明顯激活ERK和P38，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，磷酸化ERK(pERK)和磷酸化P38(p-P38)水平呈逐漸升高的趨勢(shì)，磷酸化JNK水平無(wú)明顯變化。兩組pERK和p-P38值在24h、48h和72h相比，差異均有顯著性；分別加入PD和SB的ECV304細(xì)胞中

13、VEGF蛋白的表達(dá)量明顯下降，且同一組的pERK和p-P38水平下降明顯(p<0.01)。轉(zhuǎn)染Adt-PA后可使ECV304細(xì)胞中ERK的磷酸化水平增加，此種效應(yīng)可被ERK信號(hào)通路的特異性阻斷劑PD所抑制，但不被P38信號(hào)通路特異性阻斷劑SB所抑制；同時(shí)，Adt-PA可促進(jìn)ECV304細(xì)胞中P38激酶的磷酸化水平增加，此種效應(yīng)可被SB所阻滯，并可被PD所抑制。
　　 結(jié)論：Adt-PA轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞后上調(diào)VEGF表達(dá)的過(guò)程