NKG2D配體的多靶點(diǎn)RNA干擾在NK細(xì)胞介導(dǎo)的急性肝損傷中的保護(hù)作用.pdf

1、NKG2D，凝集素樣的2型跨膜蛋白，是一種由NK細(xì)胞、NK1.1+T細(xì)胞，γδT細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞和一些髓細(xì)胞表達(dá)的刺激性免疫受體。NKG2D識(shí)別多種不同的配體，這些配體與MHCⅠ類分子遠(yuǎn)系相關(guān)，包括人的MICA/B、ULBPs和小鼠的Rae1、Mult1以及H60。這些配體雖然不是組成型表達(dá)的，但可以由壓力誘導(dǎo)表達(dá)，如病毒感染、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化或者DNA損傷。NKG2D配體的表達(dá)，使得靶細(xì)胞對NK細(xì)胞的殺傷更為敏感，并且能促進(jìn)NK細(xì)胞分

2、泌INF-γ。NKG2D活化NK細(xì)胞，在炎癥的起始和維持中發(fā)揮了重要了作用。據(jù)報(bào)道，NKG2D活化參與了NK細(xì)胞介導(dǎo)的過敏性氣道炎癥，使用NKG2D阻斷性抗體能夠延緩氣道過敏;而在腎缺血模型中，NKG2D與配體之間相互識(shí)別，會(huì)引起局部的炎癥和白細(xì)胞的聚集;通過注射非清除性的NKG2D單克隆抗體，阻斷NKG2D的信號(hào)通路，不僅對由于細(xì)胞轉(zhuǎn)輸引起的SCID小鼠的結(jié)腸炎有幫助，而且還能夠減緩膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。除此之外，近幾年我們和其他研究組也

3、都報(bào)道了，通過抗體阻斷NKG2D與配體相互作用，能夠減輕由NKG2D介導(dǎo)的乙型肝炎病毒感染群中所發(fā)生的急性肝炎。因此，阻斷NKG2D與配體的識(shí)別將成為治療各種組織局部炎癥的潛在方法。
　　 NKG2D表達(dá)在淋巴細(xì)胞上，淋巴細(xì)胞的游走性增加了靶向NKG2D的難度，而NKG2D的配體分子多表達(dá)在駐留性的細(xì)胞上，包括肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等等，所以，靶向NKG2D的配體比靶向NKG2D分子本身更易操作，且時(shí)效會(huì)更長

4、。單克隆抗體的蛋白質(zhì)本質(zhì)使得它在體內(nèi)容易發(fā)生降解，時(shí)效短，這使得它需要多次注射以達(dá)到效果并且因此造成太大的成本，因此在本研究中，我們選擇了RNA干擾技術(shù)靶向NKG2D配體進(jìn)行基因沉默。在NKG2D配體多樣性的背景下，我們構(gòu)建了多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒，通過一種單一載體表達(dá)多個(gè)分子shRNA，從而同時(shí)靶向NKG2D的多個(gè)不同配體。通過PCR擴(kuò)增得到不同靶點(diǎn)分子（Rae1，Mult1，H60以及無關(guān)序列）的shRNA轉(zhuǎn)錄單位，包括H1啟動(dòng)子、s

5、hRNA表達(dá)框以及終止子，繼而將不同的shRNA轉(zhuǎn)錄單位通過酶切和連接后串聯(lián)到腺病毒的穿梭質(zhì)粒pRNAT-H1.1/shuttle上。我們構(gòu)建了一系列多靶點(diǎn)RNA干擾載體，包括三配體干擾載體及其對照載體，包括兩配體干擾載體、單配體干擾載體，以及無關(guān)干擾載體。
　　 本論文中，我們選擇polyI:C&D-GalN聯(lián)合注射引起的爆發(fā)性肝炎和刀豆蛋白ConA注射HBsAg-Tg小鼠誘發(fā)肝損傷模型，來研究該多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒的功能。分

6、離小鼠肝內(nèi)淋巴細(xì)胞，通過定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測NKG2D各配體的mRNA、蛋白質(zhì)水平;收集小鼠血清檢測轉(zhuǎn)氨酶水平、IFN-γ和TNF-α濃度、以及組織切片觀察肝臟病理學(xué)變化;分離小鼠肝臟淋巴細(xì)胞數(shù)目、流式檢測其表型以及細(xì)胞因子分泌，觀察多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒保護(hù)肝臟損傷的分子機(jī)制。我們還構(gòu)建了針對人源NKG2D配體的多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人正常肝細(xì)胞系L-02，在與NKG細(xì)胞共同孵育后，通過51Cr釋放檢測NKG細(xì)胞殺傷

7、活性，同時(shí)流式檢測CD107a脫顆粒表達(dá)。通過上述研究方法取得結(jié)果如下:
　　 1.NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾載體的構(gòu)建
　　 首先利用siRNA設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的NKG2D配體（Rae1，Mult1和H60）的mRNA序列，選擇這幾種分子的小干擾RNA序列。通過將化學(xué)合成修飾的siRNA或者shRNA表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染到相應(yīng)的陽性表達(dá)細(xì)胞，篩選得到干擾效率最高的小干擾RNA序列，用于下一步實(shí)驗(yàn)。通過PCR擴(kuò)增得

8、到不同靶點(diǎn)分子(Rae1，Mult1，H60以及無關(guān)序列)的shRNA轉(zhuǎn)錄單位，包括H1啟動(dòng)子、shRNA表達(dá)框和下游終止子，繼而將不同的shRNA轉(zhuǎn)錄單位通過酶切和連接后串聯(lián)到腺病毒穿梭載體pRNAT-H1.1/shuttle上。
　　 2.NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾載體功能驗(yàn)證
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上構(gòu)建的一系列NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒的干擾效率，我們選擇了polyI:C聯(lián)合D-GalN誘導(dǎo)小鼠急性肝

9、臟損傷模型，這是依賴于NK細(xì)胞的由NKG2D介導(dǎo)的爆發(fā)性肝炎。聯(lián)合注射18小時(shí)后分離小鼠肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞，通過流式檢測，發(fā)現(xiàn)NKG2D多個(gè)不同配體在蛋白質(zhì)水平表達(dá)都有所上調(diào)，這也暗示了了NK細(xì)胞可能通過NKG2D與其多個(gè)不同配體的相互作用被活化。而當(dāng)我們將NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒對小鼠進(jìn)行高壓注射時(shí)，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞上NKG2D的三個(gè)配體能夠被不同程度地抑制表達(dá)，包括mRNA水平和蛋白質(zhì)水平。其中，pRNAT-shRMH能夠同

10、時(shí)抑制三種配體(Rae1、Mult1和H60)的表達(dá)，其對每個(gè)配體的抑制效率與相應(yīng)的單配體和雙配體RNA干擾質(zhì)粒幾乎一致:如pRNAT-shRMH對Rael的沉默效率同pRNAT-shRNN、pRNAT-shRMN和pRNAT-shRNH幾乎一致，這也證明了該多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒的干擾特異性?？偨Y(jié)來說，三配體RNA干擾質(zhì)粒pRNAT-shRMH同時(shí)干擾三個(gè)分子的表達(dá)，而單配體、雙配體RNA干擾質(zhì)粒只抑制其相應(yīng)的配體的表達(dá)。
　　

11、 3.NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾載體保護(hù)小鼠免受polyI:C/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝臟損傷
　　 polyI:C/D-GalN聯(lián)合注射會(huì)誘導(dǎo)小鼠發(fā)生爆發(fā)性肝臟損傷，這一過程中小鼠肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞表面NKG2D的三個(gè)不同配體都有不同程度的上調(diào)表達(dá)。那么NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒能否通過高壓注射下調(diào)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞上NKG2D的配體表達(dá)，減少NKG2D與其配體的相互作用，達(dá)到減輕損傷的目的呢？
　　 我們在polyI:

12、C/D-GalN聯(lián)合注射前3天對小鼠給予NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒及對照質(zhì)粒的高壓注射，發(fā)現(xiàn)接受過NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒預(yù)先處理的小鼠，其肝臟炎癥有不同程度的減輕，包括血清轉(zhuǎn)氨酶水平下降、血清中炎性因子IFN-γ、TNF-α濃度下降、肝臟組織切片病理程度減輕。而通過比較幾種不同的單配體RNA干擾質(zhì)粒的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)pRNAT-shRNN（僅靶向Rae1）的保護(hù)效果要明顯高于pRNAT-shNMN（僅靶向Mult1）和

13、pRNAT-shNNH(僅靶向H60)這兩種載體，說明Rael配體在這三個(gè)配體中，發(fā)揮的作用相對更大。當(dāng)在pRNAT-shRNN的基礎(chǔ)上再多干擾一種配體分子，肝臟炎癥能夠被進(jìn)一步抑制。更進(jìn)一步的是，三個(gè)配體同時(shí)被RNA干擾的質(zhì)粒pRNAT-shRMH能夠最明顯的減輕小鼠肝臟炎癥。致死劑量polyI:C/D-GalN處理后小鼠的存活率數(shù)據(jù)也支持這一結(jié)論，因?yàn)閜RNAT-shRMH處理后，小鼠的存活率從0％提高到了100％。
　　

14、RNAi的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與阻斷性抗體幾乎一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用NKG2D阻斷性單克隆抗體對小鼠預(yù)先注射后，同樣能夠有效地減輕polyI:C/D-GalN聯(lián)合注射誘導(dǎo)的急性損傷;而NKG2D配體的阻斷性抗體雖然也能不同程度低減輕炎癥(Rae1＞Mult1＞H60)，但都不能達(dá)到NKG2D抗體的效果。而用這些配體的抗體的混合物，取同樣劑量，對小鼠進(jìn)行預(yù)先干預(yù)，又能夠高效地保護(hù)小鼠因polyI:C/D-GalN引起的急性肝臟損傷，暗示了NKG2D的

15、不同配體均參與了NK細(xì)胞介導(dǎo)的NKG2D依賴的肝臟炎癥。與阻斷性抗體比起來，RNAi干擾載體在體內(nèi)發(fā)揮作用的時(shí)間要更長，也更加穩(wěn)定。
　　 我們分離小鼠肝臟淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)并檢測其表型，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)粒處理組的小鼠淋巴細(xì)胞總數(shù)及比例都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且NK細(xì)胞表面NKG2D表達(dá)也沒有變化。而pRNAT-shRMH處理組NK細(xì)胞分泌IFN-γ明顯低于對照載體pRNAT-shNNN處理組，這表明，NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒通過阻

16、斷NKG2D與配體的相互作用，抑制了NK細(xì)胞的活化。
　　 4.NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾重組腺病毒的構(gòu)建及應(yīng)用
　　 由于NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒都是通過高壓注射的方式進(jìn)入體內(nèi)進(jìn)行干預(yù)，為了改善多靶點(diǎn)RNA干擾的給藥手段，我們將NKG2D多配體shRNA表達(dá)框進(jìn)一步重組到腺病毒載體上，包裝成可應(yīng)用于臨床治療的重組腺病毒，因?yàn)橄俨《揪哂惺雀涡圆⑶腋腥拘矢?。三配體RNA干擾質(zhì)粒pRNAT-shRMH和無義

17、對照質(zhì)粒pRNAT-shNNN被進(jìn)一步改造成攜帶相應(yīng)shRNA表達(dá)框的重組腺病毒。我們發(fā)現(xiàn)，重組腺病毒Adeno-shRMH能夠通過常規(guī)的尾靜脈注射方式，達(dá)到與質(zhì)粒高壓注射相同的肝炎保護(hù)效果。而且，重組腺病毒的保護(hù)作用可以持續(xù)10天，因?yàn)樘崆?0天注射重組腺病毒Adeno-shRMH，仍然可以減輕polyI:C/D-GalN引起的爆發(fā)性肝臟損傷。
　　 5.NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾載體保護(hù)HBsAg-Tg小鼠免受ConA誘

18、導(dǎo)的急性肝臟損傷
　　 除了polyI:C/D-GalN急性損傷模型，我們想知道該載體是否在其他模型中同樣起作用。接下來，我們選擇了ConA刺激HBsAg-Tg小鼠，因?yàn)镠BsAg-Tg小鼠在ConA刺激后會(huì)誘發(fā)急性肝臟損傷，并且這是依賴于NKG2D與配體(Rae1和Mult1)相互作用的。同樣，我們提前3天給HBsAg-Tg小鼠用NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾載體進(jìn)行預(yù)先高壓注射，然后再用ConA進(jìn)行刺激，18小時(shí)后，收集小鼠

19、血清檢測轉(zhuǎn)氨酶變化以及肝臟組織病理變化。我們非常驚喜的發(fā)現(xiàn)，NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒(pRNAT-shRMH和pRNAT-shRMN)預(yù)先處理小鼠后，同樣能夠有效減輕ConA引起的肝臟炎癥。這進(jìn)一步證實(shí)了此多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒對多種不同的NKG2D介導(dǎo)的炎癥具有廣泛的保護(hù)作用。
　　 6.人源NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及其應(yīng)用
　　 為了緊密聯(lián)系臨床實(shí)際，我們進(jìn)一步針對人源NKG2D配體(MICA

20、/B、ULBP2、ULBP3)構(gòu)建了一系列多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒，包括三配體干擾質(zhì)粒、單配體干擾質(zhì)粒等。為驗(yàn)證這些質(zhì)粒的功能，我們選擇了人正常肝細(xì)胞系(L-02)，因?yàn)長-02細(xì)胞在正常情況下高表達(dá)NKG2D的多種配體，包括MICA/B，ULBP2和ULBP3。將人源NKG2D配體多靶點(diǎn)RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L-02細(xì)胞，篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的低表達(dá)細(xì)胞系，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)轉(zhuǎn)低表達(dá)細(xì)胞表面NKG2D三個(gè)配體都有不同程度的下調(diào)。51Cr細(xì)胞毒