NKG2B、NKG2D的基因克隆及其對(duì)NK細(xì)胞系YT生物學(xué)功能的影響.pdf

1、目的:NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，具有廣泛的生物學(xué)功能，位于機(jī)體抵抗腫瘤和病毒感染的第一道防線(xiàn)；不需要預(yù)先刺激即可識(shí)別并殺傷腫瘤和病毒感染的細(xì)胞，同時(shí)又能通過(guò)早期分泌多種細(xì)胞因子(如IFγ、GM-CSF和TNF-β)和趨化因子來(lái)調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答，因此，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。NK細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子不僅參與調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫，而且參與調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)的功能，在血液系統(tǒng)疾病，尤其是異基因骨髓移植中，在抑制和預(yù)防G

2、VHD，促進(jìn)GVT效應(yīng)和促進(jìn)血液和免疫系統(tǒng)重建方面起重要作用。 同時(shí)，NK細(xì)胞對(duì)自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)亦引起了人們的重視。因此，盡管關(guān)于NK細(xì)胞的發(fā)育分化和識(shí)別功能的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于T細(xì)胞和B細(xì)胞，近年來(lái)，關(guān)于NK細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)的研究引起了人們極大的興趣，并有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，成為免疫學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。 近期的研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞表面存在識(shí)別靶細(xì)胞表面分子的活化受體和抑制性受體，NK細(xì)胞的效應(yīng)功能取決于活化信號(hào)與抑制性信號(hào)的綜

3、合。抑制性受體能特異性識(shí)別靶細(xì)胞表面的MHCⅠ類(lèi)分子并保護(hù)正常細(xì)胞不被殺傷，人的NK細(xì)胞抑制性受體主要有殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killercellIg-likereceptors，KIR)和凝集素樣受體CD94/NKG2A，在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能方面起重要作用?；罨荏w識(shí)別經(jīng)典、非經(jīng)典的MHCⅠ類(lèi)分子或MHCⅠ類(lèi)相關(guān)分子，在NK活化的啟動(dòng)方面起關(guān)鍵作用，其中尤為引人注目的是NKG2D，NKG2D的配基為非經(jīng)典的MHC樣分子MICA(MH

4、CclassⅠchain-relatedA)、MICB(MHCclassⅠchain-relatedB)及ULBP(UL16-bindingprotein)，這些分子在許多上皮及非上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞和受到“應(yīng)激性刺激”的細(xì)胞均有表達(dá)或上調(diào)。研究表明，NKG2D的單獨(dú)活化即足以刺激NK細(xì)胞的活化，并能克服抑制性受體的強(qiáng)勢(shì)信號(hào)，因此，在NK細(xì)胞活化過(guò)程中起著舉足輕重的作用。而NKG2D配體的表達(dá)水平，可能決定著NKG2D的活化

5、與否。 目前世界上有六株細(xì)胞系被確認(rèn)具有典型NK細(xì)胞標(biāo)志，它們是：YT、NK-92、NKL、HANK-1、KHYG-1和NK-YS。這些細(xì)胞系的免疫表型為CD1-CD2+CD3-CD4-CD5-CD7+CD8。CD16-CD56+CD57-，具有NK活性，有/無(wú)ADCC效應(yīng)。在這些細(xì)胞系中，YT細(xì)胞，來(lái)自一急性淋巴母細(xì)胞淋巴瘤和和胸腺瘤患者，1985年建系，為IL-2非依賴(lài)或低依賴(lài)細(xì)胞系，具有NK細(xì)胞的典型表面標(biāo)志，但由于長(zhǎng)期在

6、實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，只能檢測(cè)到NKG2B和NKG2D的mRNA表達(dá)，而不能檢測(cè)到其蛋白的表達(dá)。YT細(xì)胞相對(duì)于NK-92和NKL細(xì)胞而言，其殺傷活性相對(duì)較地低。該研究選用YT細(xì)胞作為NKG2B和NKG2D轉(zhuǎn)染細(xì)胞的受體，來(lái)探討NKG2B和NKG2D分子的作用機(jī)制。 方法:(1)NKG2B和NKG2D克隆載體的構(gòu)建。從NK細(xì)胞系NK-92細(xì)胞中經(jīng)RT-PCR技術(shù)獲得NKG2BcDNA和NKG2DcDNA，與pGEM-TEasy連接及轉(zhuǎn)化

7、大腸桿菌后，構(gòu)建NKG2B和NKG2D克隆載體，進(jìn)行DNA序列測(cè)定;(2)NKG2B和NKG2D真核表達(dá)載體的構(gòu)建。應(yīng)用限制性?xún)?nèi)切酶將NKG2B和NKG2D基因從克隆載體上切下來(lái)，連接到熒光真核表達(dá)載體pEGFP-N1上，構(gòu)建pGEM-TEasy/NKG2B和pGEM-TEasy/NKG2D真核表達(dá)載體;(3)真核表達(dá)載體在CHO細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定。將篩選出的pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到

8、CHO細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選，克隆，RT-PCR鑒定NKG2B和NKG2DmRNA的表達(dá)，熒光顯微鏡、WesternBlot和免疫組化方法鑒定NKG2B和NKG2D蛋白的表達(dá);(4)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞及對(duì)YT細(xì)胞生物學(xué)功能影響。將pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染到Y(jié)T細(xì)胞中，MTT方法檢測(cè)YT細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后的增殖情況與對(duì)OMDA231、PG、Hep2和Raji腫瘤細(xì)胞的殺傷情況，RT-

9、PCR技術(shù)檢測(cè)殺傷相關(guān)分子中，抗病毒分子IFNγ、細(xì)胞增殖分子IL-2、溶膜分子perforin和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分子家族TNF超家族(TNFα、Fas/FasL、TRAIL、TWEAK)的轉(zhuǎn)錄水平，并同時(shí)設(shè)置β-actin為RT-PCR系統(tǒng)的內(nèi)參照。 結(jié)果: 一、NKG2B和NKG2D全長(zhǎng)cDNA的克隆提取新鮮培養(yǎng)的NK-92細(xì)胞的總RNA，取5ug總RNA為模板，以oligo(dT)為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后用NKG2B

10、和NKG2D的特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定和與pGEM-TEasy載體連接、酶切鑒定后測(cè)序，證實(shí)已獲得的cDNA為NKG2B和NKG2D的全長(zhǎng)cDNA，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。 二、pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D重組表達(dá)載體的構(gòu)建用PstⅠ和XhoⅠ從克隆載體pGEM-TEasy/NKG2B切下NKG2B片段，與經(jīng)相同雙酶切的pEGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行粘端連接；同樣用EcoRⅠ和BamHⅠ從

11、克隆載體pGEM-TEasy/NKG2D切下NKG2D片段，與經(jīng)相同雙酶切的pEGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行粘端連接。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌HB101，利用PCR篩選陽(yáng)性克隆，提取純化PCR陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定陽(yáng)性的克隆即為構(gòu)建好的pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D重組表達(dá)載體。 三、NKG2B和NKG2D在CHO細(xì)胞中的表達(dá)應(yīng)用脂質(zhì)體法將構(gòu)建好的pEGFP-N1/NKG2B和pEGF

12、P-N1/NKG2D重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，G418篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)后，挑選抗性克隆，RT-PCR鑒定mRNA的表達(dá)，熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光發(fā)出、WesternBlot和免疫組化方法鑒定蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示構(gòu)建的pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D質(zhì)粒能夠轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并且有NKG2B和NKG2D的蛋白表達(dá)。 四、NKG2B和NKG2D真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞及對(duì)其生物學(xué)功能影響應(yīng)用脂質(zhì)體法將構(gòu)建

13、好的pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞，MTT方法測(cè)定轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞增殖效應(yīng)和對(duì)OMDA231、PG、Hep2和Raji腫瘤細(xì)胞的殺傷情況，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)殺傷功能相關(guān)分子的變化。結(jié)果顯示YT細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后增殖效應(yīng)沒(méi)有變化；NKG2B轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞后對(duì)OMDA231、PG、Hep2細(xì)胞殺傷活性無(wú)變化，而對(duì)Raji有增強(qiáng)作用，殺傷相關(guān)分子IFNγ、FasL、TRAIL有明顯降低。NKG2

14、D轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞后對(duì)OMDA231、PG、Hep2和Raji細(xì)胞殺傷活性均有增強(qiáng)作用，殺傷相關(guān)分子IFNγ、IL-2、TNFα、Perforin、TWEAK有明顯增強(qiáng)。 結(jié)論: (1)通過(guò)基因工程技術(shù)獲得了全長(zhǎng)的NKG2B和NKG2D基因片段，并且測(cè)序正確，成功構(gòu)建了pEGFP-N1/NKG2B和pEGFP-N1/NKG2D真核表達(dá)載體。 (2)經(jīng)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，能夠在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光，RT-PCR檢測(cè)出

15、mRNA的表達(dá)，WesternBlot和免疫組化方法鑒定蛋白的表達(dá)。 (3)轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前后增殖效應(yīng)沒(méi)有變化；NKG2B轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞后對(duì)OMDA231、PG、Hep2細(xì)胞殺傷活性無(wú)變化，而殺傷相關(guān)分子IFNγ、FasL、TRAIL有明顯降低。NKG2D轉(zhuǎn)染YT細(xì)胞后對(duì)OMDA231、PG、Hep2和Raji細(xì)胞殺傷活性均有增強(qiáng)作用，殺傷相關(guān)分子IFNγ、IL-2、TNFα、Pefforin、TWEAK有明顯增強(qiáng)。