HIV vpr上調(diào)NKG2D的配體和介導(dǎo)NK細(xì)胞毒效應(yīng)的研究.pdf

1、背景:病毒蛋白R(shí)(virus protein R，vpr)是人免疫缺陷病毒(humanimmunodefifiency virus，HIV)基因組的4個(gè)輔助基因之一。vpr基因產(chǎn)生的Vpr蛋白在HIV感染宿主細(xì)胞的過程和艾滋病(acquiredimmunodefifiency syndrome，AIDS)的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。它參與病毒整合前復(fù)合體的核轉(zhuǎn)運(yùn)，激活病毒的轉(zhuǎn)錄過程，誘導(dǎo)細(xì)胞周期的G2/M期停滯，促進(jìn)感染細(xì)胞凋亡。NKG2D

2、是NK細(xì)胞表面主要的活化型受體之一，與其配體ULBPs結(jié)合后傳導(dǎo)活化信號(hào)，誘導(dǎo)NK細(xì)胞毒效應(yīng)以殺傷靶細(xì)胞。本文將研究HIV-1 Vpr對(duì)ULBPs表達(dá)的影響，證實(shí)vpr基因是激活NKG2D的配體并介導(dǎo)NK細(xì)胞毒效應(yīng)的病毒因素之一。
　　目的:體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染了HIV vpr基因的jurkat細(xì)胞表面的NKG2D配體ULBP1和ULBP2的表達(dá)情況，印證本研究室前期觀察的HIV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞表面的NKG2D配體ULBP

3、1和ULBP2較正常人上升的實(shí)驗(yàn)結(jié)果;細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中以抗體封閉NK細(xì)胞表面的NKG2D受體后，觀察其對(duì)vpr表達(dá)陽(yáng)性的jurkat細(xì)胞殺傷力的變化，探索HIV-1 Vpr可能通過調(diào)節(jié)NKG2D配體的表達(dá)，激活NK細(xì)胞毒效應(yīng)殺傷CD4+T淋巴細(xì)胞的分子機(jī)制。本研究將有助于進(jìn)一步闡明HIV-1的致病機(jī)制，為艾滋病的治療尋找新的有效分子靶點(diǎn)打下基礎(chǔ)。
　　方法:目的基因HIV-1 vpr來自BSXCYPYVPRXCTHY質(zhì)粒。送質(zhì)粒DNA

4、測(cè)序以鑒定vpr片段的基因系列。將vpr用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞株jurkat細(xì)胞，用含1640和胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)三天后，RT-PCR檢測(cè)目的基因mRNA水平的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染了vpr基因、轉(zhuǎn)染了空載體和未轉(zhuǎn)染的jurkat細(xì)胞表面ULBP1/ULBP2配體雙陽(yáng)性表達(dá)水平。密度梯度離心法從外周靜脈血中分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，磁珠分選出NK細(xì)胞（CD56陽(yáng)性細(xì)胞），臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞后，以來自健康正常人和

5、HIV-1感染者的NK細(xì)胞和NKG2D抗體封閉的NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染了vpr基因和未轉(zhuǎn)染vpr和PCD基因的jurkat細(xì)胞為靶細(xì)胞，效靶比為:9∶1，通過細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)比較效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。
　　結(jié)果:DNA測(cè)序結(jié)果表明BSXCYPYVPRXCTHY質(zhì)粒攜帶的DNA片段與HIV vpr已知基因序列完全一致;用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將vpr基因片段和PCD空載體分別轉(zhuǎn)染至jurkat細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)到目的基因vpr的表達(dá)。

6、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到轉(zhuǎn)染了vpr基因的jurkat細(xì)胞表面ULBP1/ULBP2配體雙陽(yáng)性表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染vpr基因的細(xì)胞升高。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明NKG2D封閉后的NK細(xì)胞對(duì)jurkat細(xì)胞的殺傷力下降;來自HIV感染者的NK細(xì)胞對(duì)jurkat細(xì)胞殺傷力低于來自正常人的NK細(xì)胞。
　　結(jié)論:1.轉(zhuǎn)染了HIV vpr基因片段的jurkat細(xì)胞表面ULBP1/ULBP2受體雙陽(yáng)性表達(dá)水平較PCD轉(zhuǎn)染組和空白組的表達(dá)水平升高，提示HIV-1 V

7、pr能上調(diào)jurkat細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本研究室之前的臨床研究結(jié)果:HIV感染者CD4+T淋巴細(xì)胞表面的NKG2D配體ULBP1和ULBP2表達(dá)較正常人升高;并排除其他基因產(chǎn)物的影響，進(jìn)一步表明vpr在其中的關(guān)鍵作用。2.NK細(xì)胞表面的NKG2D受體被特異性抗體封閉后，較未封閉NKG2D受體的NK細(xì)胞對(duì)jurkat細(xì)胞殺傷力下降，揭示vpr感染后，NK細(xì)胞通過活化性受體NKG2D與配體ULBP-1和UL