氧化應(yīng)激對(duì)NKG2D配體表達(dá)的影響.pdf

1、NKG2D是淋巴細(xì)胞活化型受體之一，主要表達(dá)在NK細(xì)胞、CD8+αβT細(xì)胞、γδT細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，在免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用。NKG2D有多種配體，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的配體包括人的UL—16結(jié)合蛋白(UL—16 binding proteins，ULBPs)、非經(jīng)典性MHCI類鏈相關(guān)分子A/B(MHC class I chain—related molecules A/B，MICA/B)和鼠的維甲酸誘導(dǎo)的基因(Retinoic acid

2、inducible genes—1，RAE1，α、β、γ、δ、ε)、次要組織相容性抗原H60(the minor hitoeompatibility antigen，H60，a，b，c)和鼠的ULBP樣轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1(murine ULBP—like transcript1，MULT1)。NKG2D配體分子在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，但在腫瘤組織或處于氧化應(yīng)激、熱休克、病毒感染等應(yīng)激狀態(tài)時(shí)表達(dá)上調(diào)。據(jù)報(bào)道，氧化應(yīng)激可使氣道上皮細(xì)胞NKG2D

3、配體的某些分子表達(dá)上調(diào)。本工作旨在研究氧化應(yīng)激對(duì)NKG2D配體表達(dá)及其功能的影響。主要工作如下：
　　 一、氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞NKG2D配體表達(dá)影響的研究
　　 我們選取8種腫瘤細(xì)胞以及從正常人外周血中分選T細(xì)胞和單核來(lái)源的樹突狀細(xì)胞(the monocyte—derived dendritic cell，moDC)，在培養(yǎng)基中加H2O2使其處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。應(yīng)用RT—PCR、Real—time PCR和流式細(xì)胞儀等方法分別

4、從mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)腫瘤細(xì)胞ULBPs及MICA/B的表達(dá)變化，流式細(xì)胞儀分析氧化應(yīng)激對(duì)T細(xì)胞和moDC ULBPs及MICA/B表達(dá)的影響。并針對(duì)氧化應(yīng)激前后不同腫瘤細(xì)胞ULBPs及MICA/B表達(dá)的不同變化，選取五種細(xì)胞分析其變化對(duì)NK細(xì)胞功能的影響。結(jié)果顯示，無(wú)論是腫瘤細(xì)胞，還是正常細(xì)胞都僅表達(dá)眾多NKG2D配體中的一種或幾種，而且各種細(xì)胞的表達(dá)譜各不相同。細(xì)胞NKG2D配體在mRNA水平與細(xì)胞表面的蛋白表達(dá)并不完全一致；

5、其中BGC823細(xì)胞表面蛋白與mRNA的表達(dá)較為一致。在氧化應(yīng)激之后各種配體的表達(dá)都有所升高，293T、gaji和K562細(xì)胞的大多數(shù)NKG2D配體在氧化應(yīng)激之后都有不同程度的提高。而Jurkat、HO8910、HeLa和Daudi細(xì)胞表面表達(dá)的配體種類很少，并且表達(dá)情況在應(yīng)激前后幾乎沒(méi)有變化。新鮮分離的T細(xì)胞應(yīng)激前僅表達(dá)低水平的ULBP2，而不表達(dá)MICA；氧化應(yīng)激后誘導(dǎo)出現(xiàn)MICA表達(dá)而ULBPs的表達(dá)沒(méi)有變化。moDC廣泛表達(dá)多種

6、NKG2D配體，但應(yīng)激前后表達(dá)水平變化不大。氧化應(yīng)激增強(qiáng)了NK細(xì)胞對(duì)BGC823、Raji細(xì)胞的殺傷功能，且此效應(yīng)可被anti—NKG2D抗體阻斷。氧化應(yīng)激前后NK細(xì)胞對(duì)293T、Jurkat和HeLa細(xì)胞的殺傷作用變化不顯著。
　　 二、小鼠氧化應(yīng)激模型中NKG2D配體的表達(dá)研究
　　 建立小鼠吸入臭氧的動(dòng)物氧化應(yīng)激模型，利用RT—PCR、Real—time PCR和免疫組化方法分析氧化應(yīng)激對(duì)小鼠各組織Rael和MUL

7、T1表達(dá)的影響。并用流式細(xì)胞儀分析氧化應(yīng)激前后小腸上皮細(xì)胞(iIEL)、脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞的Rael和MULT1的表達(dá)情況。Real—time PCR結(jié)果顯示，應(yīng)激后Rael的表達(dá)在皮膚和淋巴結(jié)有所降低，在胸腺、小腸、脾臟表達(dá)升高。MULT1的表達(dá)在皮膚和小腸略有升高，但變化不明顯；MULT1在脾臟和淋巴結(jié)的表達(dá)下降，在胸腺基本沒(méi)有變化。而免疫組織化學(xué)的結(jié)果表明，小鼠氧化應(yīng)激后，MULT1在胸腺的表達(dá)降低，在淋巴結(jié)的表達(dá)略有升高，在脾臟