氧化應(yīng)激對(duì)HepG2細(xì)胞HMGB1表達(dá)和釋放的影響.pdf

1、目的：
　　 高遷移率族蛋白B1(HighMobilityGroupBoxProtein1，HMGB1)是生物有機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞因子，在細(xì)胞核內(nèi)和核外發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，HMGB1與肝臟炎癥損傷也密切相關(guān)。雖然肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞不主動(dòng)釋放HMGB1，但氧化應(yīng)激是否能夠誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞釋放HMGB1并不清楚。本研究目的在于了解氧化應(yīng)激與肝細(xì)胞釋放HMGB1的關(guān)系。
　　 方法：
　　 以體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)

2、對(duì)象，用H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型，觀察HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激各項(xiàng)指標(biāo)：丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)活性、以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GlutathionePeroxidase，GSH-Px)活性，確定氧化應(yīng)激模型成功建立。用N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine，NAC)和雷帕霉素(Rapamycin，RPM)分別處理H2

3、O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，觀察細(xì)胞HMGB1表達(dá)、轉(zhuǎn)位和釋放：ELISA(Enzyme-LinkedImmunoadsorbentAssay)方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1的釋放，免疫細(xì)胞化學(xué)方法和熒光染色方法觀察HMGB1蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的分布，RT-PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction)方法檢測(cè)HMGB1mRNA的表達(dá)，分析氧化應(yīng)激對(duì)HepG2細(xì)胞HM

4、GB1表達(dá)、轉(zhuǎn)位和釋放的影響，探索NAC和RPM對(duì)氧化應(yīng)激模型HepG2細(xì)胞HMGB1表達(dá)、轉(zhuǎn)位和釋放的作用。
　　 結(jié)果：
　　 用100μmol/L的H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞能夠成功建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，在H2O2誘導(dǎo)16h后，應(yīng)激組細(xì)胞存活率與對(duì)照組差異沒(méi)有顯著性，但氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA含量、SOD和GSH-Px活性變化顯著。用H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立的氧化應(yīng)激模型中，HMGB1表達(dá)增加，并有HMGB1轉(zhuǎn)位至

5、細(xì)胞質(zhì)，而且釋放至胞外上清液中的的HMGB1量顯著增多；用NAC作用于HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激細(xì)胞模型能夠顯著減少其HMGB1的表達(dá)和釋放，而雷帕霉素作用于HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激細(xì)胞模型可抑制HMGB1的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，但不影響氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞表達(dá)HMGB1。
　　 結(jié)論：
　　 一、為進(jìn)一步揭示氧化應(yīng)激與HMGB1表達(dá)、轉(zhuǎn)位和釋放的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型：在H2O2濃度100

6、μmol/L作用16h后，肝細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著降低，而MDA含量、SOD和GSH-Px活性發(fā)生了顯著變化。HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、HepG2細(xì)胞在H2O2誘導(dǎo)16h后，細(xì)胞表達(dá)HMGB1顯著增強(qiáng)，并且出現(xiàn)HMGB1細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1釋放顯著上升。HepG2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激與HMGB1表達(dá)、轉(zhuǎn)位和釋放存在聯(lián)系。
　　 三、N-乙酰半胱氨酸能夠有效抑制H2O2誘