Kupffer細(xì)胞表達(dá)的Fas配體在急性胰腺炎肝損傷中的作用.pdf

1、急性胰腺炎(acutepancreatitis，AP)是一種多系統(tǒng)疾病，其不但累及胰腺，而且累及肝、肺、腎臟等器官，在重癥時(shí)死亡率高達(dá)20％～30％。目前認(rèn)為單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)異常激活并產(chǎn)生過多的細(xì)胞因子是AP時(shí)多器官功能不全綜合征(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)發(fā)生的主要機(jī)理。由于胰腺血液在回流心臟前需經(jīng)過肝臟的代謝和處理，而肝臟的Kupffer細(xì)胞占整個(gè)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的80％～90％，是

2、體內(nèi)最大的固定巨噬細(xì)胞群，因此肝臟是AP常累及的胰外器官之一，其對AP的病情發(fā)展也可能有重要影響。而且，肝功能損害已被認(rèn)為是判斷AP嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，已作為獨(dú)立的指標(biāo)合并進(jìn)了預(yù)測AP嚴(yán)重程度的Ranson評分和急性生理慢性健康評估II(AcutePhysiologicalChronicHealthEvaluationII，APACHEII)系統(tǒng)，對預(yù)測AP臨床預(yù)后尤為重要。 早在1984年就有報(bào)道，80％AP患者有肝功能損害，

3、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase，AST)和乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)水平升高，并且LDE水平與AP的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)研究表明，AP時(shí)可見明顯的肝細(xì)胞病理改變。光鏡下，可見肝細(xì)胞變性、散在的液化性壞死灶，Kupffer細(xì)胞腫脹。電鏡下，可見糖原顆粒減少；脂質(zhì)小滴大小和數(shù)目增加；線

4、粒體腫脹，其基質(zhì)和嵴變性；自噬體和溶酶體增多；肝竇內(nèi)皮損害伴吞噬細(xì)胞活性增加。并出現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)酸中毒、鈉離子超載及肝細(xì)胞生物能的耗竭等生化改變以及肝細(xì)胞凋亡顯著增多。 關(guān)于AP時(shí)肝臟損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，可能累及多種因素，主要包括：胰酶、氧自由基、一氧化氮以及細(xì)胞因子等。關(guān)于胰酶在AP時(shí)肝臟損傷過程中的作用，將胰彈性蛋白酶注入小鼠腹腔，發(fā)現(xiàn)血清AST、ALT、LDH顯著升高，肝臟中性粒細(xì)胞浸潤增加，與缺乏膽堿的乙硫氨酸飲食誘

5、發(fā)的小鼠AP時(shí)肝損傷表現(xiàn)相一致；注射胰彈性蛋白酶30min后發(fā)生核因子κB(Nuclearfactor-kappaB，NF-κB)激活；胰彈性蛋白酶腹腔注射和缺乏膽堿的乙硫氨酸飲食均可導(dǎo)致小鼠血清腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)蛋白和肝臟TNF-αmRNA表達(dá)增強(qiáng)；p38-促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)抑制劑CNI-1493

6、可降低肝臟酶學(xué)改變、髓過氧化物酶活性、TNF-αmRNA及其蛋白表達(dá)。提示肝臟暴露于胰彈性蛋白酶可導(dǎo)致與AP相似的肝臟炎癥和損傷；抑制肝臟內(nèi)白細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)可減輕肝損傷。已有認(rèn)為胰彈力蛋白酶誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生細(xì)胞因子的機(jī)制是通過激活Kupffer細(xì)胞內(nèi)NF-κB，釓?fù)ㄟ^抑制NF-κB激活對胰彈力蛋白酶誘導(dǎo)的肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用。最近實(shí)驗(yàn)研究表明胰彈性蛋白酶是通過直接激活全身性炎性細(xì)胞而使胰腺局部炎癥擴(kuò)散至全身的主要因素。 目前，細(xì)胞

7、因子在AP發(fā)病機(jī)制中的作用已成為研究和討論的熱點(diǎn)。研究表明，AP肝損傷是通過肝組織內(nèi)巨噬細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)產(chǎn)生的TNF介導(dǎo)的。然而，TNF介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡不能完全解釋肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度。Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生的其他細(xì)胞因子是否參與AP肝損傷，目前還不很清楚。 Fas是屬于TNF受體家族的一種細(xì)胞表面蛋白，而Fas配體(FaSLigand，F(xiàn)asL)是TNF家族的成員之一。FasL由激活的淋巴細(xì)胞(如T細(xì)胞和NK細(xì)胞

8、)產(chǎn)生，其功能是作為這些細(xì)胞毒細(xì)胞的效應(yīng)子來清除被病毒及細(xì)菌感染的細(xì)胞或新生物細(xì)胞。雖然有報(bào)道表明FasL介導(dǎo)的凋亡在肝病、急性腎衰竭和甲狀腺炎的實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷中起著重要的作用。然而，關(guān)于AP時(shí)在Kupffer細(xì)胞中FasL的表達(dá)及其在肝細(xì)胞損傷中的作用，卻少見報(bào)道。 基于此，本研究將通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立AP模型，利用ELISA、Westernblot等技術(shù)研究實(shí)驗(yàn)性AP肝損傷時(shí)Kupffer細(xì)胞FasL的表達(dá)情況，并通過氯化釓進(jìn)行干

9、預(yù)研究，結(jié)合肝功能、病理形態(tài)學(xué)改變，明確Kupffer細(xì)胞和肝細(xì)胞之間的相互作用，以從分子水平闡明AP肝損傷的發(fā)病機(jī)制，為AP肝損傷臨床治療提供一個(gè)新的思路。 [目的]： 以AP肝損傷作為研究對象，通過動物實(shí)驗(yàn)對肝臟Kupffer細(xì)胞表達(dá)的FasL在其中的作用及Kupffer細(xì)胞抑制劑氯化釓(Chloridategadolinium，GdCl3)對肝損傷的保護(hù)作用進(jìn)行觀察，以期對AP疾病進(jìn)程中胰外器官損傷發(fā)生率高、病死率

10、高的原因進(jìn)行初步探討，為臨床最終達(dá)到提高AP療效、減少AP的并發(fā)癥及降低其病死率提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [材料和方法]：雄性美國癌癥研究所(InstituteofCancerResearcch，ICR)小鼠54只(20-25g)，隨機(jī)分為正常對照組(n=6)、AP組(n=24)和GdCl3預(yù)處理+AP組(AP+Gd組，n=24)，后兩組均以不同的時(shí)間點(diǎn)分為4個(gè)亞組，每組6只。正常對照組予腹腔注射生理鹽水0.1ml后4h心臟穿刺抽血

11、，并處死小鼠，留取標(biāo)本；AP模型制備采用間隔4h共1-6次不等腹腔注射膽囊收縮素類似物雨蛙素(50μg/kg次)；AP+Gd組在誘發(fā)AP前24h尾靜脈注射GdCl3(10mg/kg)，然后注射雨蛙素誘發(fā)AP(方法同AP組)。AP組和AP+Gd組最后分別在誘發(fā)AP后4h、8h、16h、24h心臟穿刺抽血，并處死小鼠，留取標(biāo)本。用自動生化儀檢測血清ALT、AST、LDH和淀粉酶(amylzyme，AMY)的濃度、用ELISA試劑盒檢測血清F

12、asL水平和用westernblot檢測肝臟FasL蛋白的表達(dá)。 本研究所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS13.0軟件，計(jì)量資料第一部分采用單因素方差分析，第二部分采用2×4析因分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果]：(1)誘發(fā)AP后4h、8h、16h和24h血清AST、ALT、LDH、AMY水平明顯高于正常對照組(P<0.05)，而用Kupffer細(xì)胞抑制劑GdCl3預(yù)處理則

13、明顯降低AP時(shí)預(yù)期升高的各個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)血清AST、ALT、LDH、AMY水平(P<0.05)。(2)誘發(fā)AP后4h、8h、16h和24hAP組血清FasL濃度(505.94±36.21，496.60±33.65，476.64±22.66，450.75±38.21)顯著高于正常對照組(83.60±7.75)，上述結(jié)果和正常對照組相比差異顯著(P<0.05)；GdCl3預(yù)處理組在4h、8h、16h和24h時(shí)血清FasL濃度(211.37±2

14、4.86，201.51±18.32，197.48±17.68，190.8±20.78)顯著低于AP組相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)的濃度，和AP組結(jié)果相比差異顯著(P<0.05)。(3)誘發(fā)AP后4h、8h、16h和24h肝臟FasL蛋白的表達(dá)相比正常對照組明顯增加，和正常對照組相比差異顯著(P<0.05)；用GdCl3預(yù)處理則明顯減少肝臟FasL蛋白的表達(dá)，和AP組結(jié)果相比差異顯著(P<0.05)。 [主要結(jié)論]： (1)AP病程中，K

15、upffer細(xì)胞在炎癥反應(yīng)放大、胰外器官損傷中起著重要的作用。 (2)AP時(shí)，Kupffer細(xì)胞表達(dá)的FasL上調(diào)介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，其可能是通過活化的TNF受體家族成員Fas，F(xiàn)asL激活Fas相關(guān)的死亡域和暴露死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域隨后活化caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致DNA裂解和肝細(xì)胞凋亡。 (3)GdCl3可顯著減輕AP肝損傷，其可能是通過抑制FasL的表達(dá)，從而抑制肝細(xì)胞的凋亡通路進(jìn)而達(dá)到保護(hù)作用，提示針對Kupffer