P物質在大鼠急性胰腺炎肝損傷中的作用.pdf

1、急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床上常見的急腹癥之一，常常并發(fā)肝、腎、肺、腸道等胰外器官損傷。AP肝損傷的機制仍未完全闡明，目前的研究認為與炎性細胞因子、肝細胞凋亡、氧化應激、微循環(huán)障礙等多種因素有關，是一個復雜的病理生理過程。 P物質(substance P)是神經(jīng)肽中速激肽家族的重要成員，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)，具有痛覺傳導、神經(jīng)源性炎癥、內臟平滑肌收縮及血管擴張等許多生物學活性。P

2、物質在調節(jié)炎性細胞的游走中具有重要作用，可引起中性粒細胞的趨化以及白細胞介素8(IL-8)的合成與釋放，同時還可引起肥大細胞釋放組胺，從而促成炎癥反應發(fā)生，是神經(jīng)纖維與炎性細胞間相互作用的介質。P物質與神經(jīng)激肽受體1(neurokinin receptor,NK-1R)親合力最強，因而NK-1R又稱為P物質受體。NK-1R在神經(jīng)細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、以及炎性細胞(如淋巴細胞、單核巨噬細胞、中性粒細胞)的細胞膜上表達。P物質與N

3、K-1R結合后，可以抑制胰腺外分泌，減輕各種消化酶對胰腺及胰周組織的損害。但同時還引起血管擴張、白細胞黏附血管壁并游出血管外、血漿外滲等反應。P物質引起的反應實質上是機體對外界有害刺激的防御反應，但過分劇烈則產(chǎn)生不良后果。AP患者肝功能異常率高，肝功能的損害程度與AP病情呈正相關，而一旦發(fā)生肝衰竭則預后不良。研究P物質在急性胰腺炎肝損傷時的作用對揭示AP肝損傷機制和提供治療思路具有一定的意義。目的： 研究通過建立大鼠AP模型，并

4、給予NK-1R拮抗劑L-703,606干預，觀察肝臟中P物質、NK-1R的表達以及肝細胞凋亡的情況，探討P物質在AP肝損傷中的作用，探討NK-1R拮抗劑對AP肝損傷的治療作用。 方法： 1.動物模型的制備：選取Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，取上腹正中作切口進入腹腔，以4號手術線結扎近肝門端胰膽管，然后用4號加工鈍頭頭皮靜脈針于十二指腸乳頭附近逆行插入胰膽管，以0.2ml/mi

5、n速度注入5％?；悄懰徕c(0.1ml/100g)，推藥后以左手拇指按緊胰膽管入十二指腸處，觀察3min，待胰腺出現(xiàn)明顯充血后，剪去結扎線，關腹。 2.實驗分組：將雄性SD大鼠54只，隨機分為假手術組(SO group，n=18)、AP模型組(AP group，n=18)、AP+L-703,606組(AP+L-703,606 group，n=18)，后以不同時間點3h、6h、12h分為3個亞組。其中AP+L-703,606組于造模

6、前15min腹腔內注射L-703,606(250nmol/kg)。 3.生化指標測定：取血清樣本，采用全自動血清生化分析儀檢測血清淀粉酶、脂肪酶、谷丙轉氨酶(alanineaminotransferase，ALT)由河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生化室協(xié)助測定。 4 肝臟和胰腺組織學檢查：采用石蠟切片，HE染色。 5 肝臟P物質和NK-1R的免疫組織化學染色：石蠟切片脫蠟至水，抗原熱修復，3％過氧化氫孵育15min，山羊血

7、清封閉30min，滴加一抗4℃過夜。陰性對照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各15min，后用3，3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色，蘇木素復染后封片。以細胞漿內呈現(xiàn)黃褐色顆粒為陽性表達。 6 凋亡測定：采用TUNEL檢測試劑盒檢測肝細胞的凋亡。 結果： 1.大鼠胰腺的病理學變化：肉眼和光鏡所見SO組胰腺及周圍組織結構始終大致正常；AP組和AP+L-703,606組，胰腺及周圍組織水腫、出血、壞死，且隨時間延長損傷程度逐

8、漸加重，腹水和中性粒細胞也逐漸增多； 2.大鼠肝臟的病理學變化：肉眼和光鏡所見SO組肝臟組織結構始終正常；AP組和AP+L-703,606組隨時間推移，肝細胞腫脹、變性、壞死和肝索結構解離破壞的范圍逐漸增大，程度逐漸加重，炎性細胞浸潤也增多。但AP+L-703,606組較AP組肝臟組織的損傷程度較輕。 3.血清淀粉酶的變化：在各時間點，SO組無明顯變化，AP組和AP+L-703,606組與SO組比較均顯著升高(P＜0.0

9、1)。AP組和AP+L-703,606組間無差異。 4 血清脂肪酶的變化：在各時間點，SO組無明顯變化，AP組和AP+L-703,606組與SO組比較均顯著升高(P＜0.05)。AP組和AP+L-703,606組間無差異。 5 血清谷丙轉氨酶的變化：各時間點，SO組無明顯變化，AP組和AP+L-703,606組與SO組比較均顯著升高(P＜0.05)。AP組和AP+L-703,606組間無差異，但AP+L-703,606組

10、各時間點均低于AP組。 6 肝臟P物質變達的變化：SO組，有散在分布的P物質表達于肝細胞胞漿內，成棕黃色顆粒。AP組和AP+L-703,606組，均有較強的表達。免疫組化評分顯示AP+L-703,606組表達強度低于AP組。 7 肝臟NK-1R表達的變化：SO組，NK-1R表達于肝細胞胞漿，染色為棕黃色顆粒。AP組和AP+L-703,606組表達均強于SO組。免疫組化評分顯示AP+L-703,606組表達較AP組弱。 8

11、 肝細胞凋亡的變化：SO組幾乎沒有陽性細胞表達，AP組和AP+L-703,606組均可見細胞核呈棕黃色染色的陽性細胞，且隨時間延長數(shù)量增加。但AP+L-703,606組數(shù)量少于AP組。 結論： 1.逆行膽胰管內注射5％?；悄懰徕c，血清淀粉酶、脂肪酶升高，胰腺組織HE染色觀察到胰腺及周圍組織水腫、出血和壞死等表現(xiàn)，證實大鼠AP模型制備成功。 2.AP組和AP+L-703,606組大鼠血清ALT均明顯升高，HE巳染色

12、觀察到肝臟組織結構破壞，肝細胞變性、壞死，TUNEL檢測到明顯的肝細胞凋亡，說明AP時大鼠肝臟出現(xiàn)損傷。 3.AP大鼠肝臟組織中P物質及其受體NK-1R表達增加，表明P物質與AP肝損傷有密切聯(lián)系。 4 L-703,606是NK-1R的特異性拮抗劑，它通過阻斷P物質與NK-1R結合抑制P物質發(fā)揮生物學效應。給予L-703,606后P物質和NK-1R表達降低，血清ALT降低，肝細胞凋亡減少，肝臟組織損傷減輕。因此認為，AP時