XOD誘導人肝細胞系L-02細胞自噬模型的建立及線粒體機制研究.pdf

1、背景：
　　自噬（autophagy）是一種自我消化過程，可將各種待消化物質(zhì)降解成為能夠被重新利用的營養(yǎng)成分，從而達到在清除受損細胞器或大分子的同時最大限度地利用自身營養(yǎng)成分的目的。自噬是一種普遍存在的生命現(xiàn)象，它在眾多生理及病理條件下均發(fā)揮重要作用。正常條件下，細胞的自噬維持在一個相對較低的水平，但多種應激條件可誘導自噬水平的升高，包括氧化應激。氧化應激是指機體或細胞產(chǎn)生的過多活性氧（reactive oxygen specie

2、s，ROS）無法被抗氧化防御體系所清除，造成的應激作用。氧化應激與自噬的相關(guān)性已有很多文獻報道，但具體機制仍不清楚。在以往氧化應激與自噬的研究中，自噬通常伴有大量凋亡或壞死，為一種病理性損傷性自噬，而氧化應激誘導生理性自噬研究甚少。
　　黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）是一種將黃嘌呤、次黃嘌呤分解并產(chǎn)生ROS的氧化還原酶，已被作為氧化劑廣泛應用于研究中。本研究在篩選氧化劑誘導自噬模型過程中，發(fā)現(xiàn)XOD可明顯

3、誘導L-02細胞自噬，那么該模型與經(jīng)典自噬模型以及已有的氧化應激誘導的自噬模型有何優(yōu)勢？其中機制如何？對以上問題的系統(tǒng)研究將對建立優(yōu)效的氧化應激誘導自噬模型，以及針對自噬的分子機制和生物學作用研究提供數(shù)據(jù)和支撐。
　　目的：
　　1．建立一種XOD誘導的細胞自噬模型；
　　2．探討XOD誘導自噬模型過程中線粒體氧化應激作用及分子機制。
　　方法：
　　1．體外培養(yǎng)L-02細胞，采用不同濃度氧化劑（H2O2、

4、GOX、t-BHP、PQ和XOD）、自噬誘導劑（EBSS和Rapamycin）、自噬抑制劑（3-MA）以及多種抗氧化劑（NAC、和MitoQ）對細胞進行處理；
　　2．采用免疫熒光檢測自噬標志蛋白LC3Ⅱ分布狀況,MDC染色檢測自噬溶酶體數(shù)量及分布；
　　3．Western Blot檢測標志蛋白LC3Ⅱ、p62等蛋白水平以及AKT、ERK、AMPK、p38、mTOR和ULK1等細胞信號通路分子的激活狀況；
　　4．透射

5、電子顯微鏡觀察線粒體和細胞自噬小體的形態(tài)及數(shù)量；
　　5．DCFH-DA和Mito-SOX Red染色流式法分別檢測細胞ROS和線粒體ROS水平；
　　6．JC-1染色，共聚焦觀察細胞膜電位變化；
　　7．Mn-SOD及CAT試劑盒檢測細胞內(nèi)SOD2及CAT活性；
　　8．熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)線粒體DNA拷貝數(shù)；
　　9. mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染細胞，以觀察細胞自噬通量；
　　10．采

6、用siRNA對細胞內(nèi)Atg5基因進行干擾，降低Atg5蛋白的表達；
　　11．采用慢病毒轉(zhuǎn)染細胞以單獨高表達細胞內(nèi)SOD2、CAT以及M-CAT，或共轉(zhuǎn)染同時高表達SOD2&CAT以及SOD2&M-CAT；
　　12．Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡水平。
　　結(jié)果：
　　1．L-02細胞活力隨各氧化劑（H2O2、GOX、t-BHP、PQ和XOD）濃度增大而降低，一定濃度H2O2、

7、t-BHP、PQ和XOD處理條件下，自噬標志蛋白LC3Ⅱ水平均有不同程度升高。
　　2．L-02細胞經(jīng)無細胞毒性劑量 XOD處理后，MDC染色結(jié)果顯示，指示酸性自噬泡的藍色熒光點明顯增多且亮度增強，免疫熒光法標記LC3蛋白的熒光點增多， Western Blot檢測的LC3Ⅱ蛋白水平明顯上調(diào)，TEM結(jié)果顯示細胞的自噬體形成增加，各指標均呈一定的劑量效應關(guān)系。mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染 L-02細胞后再給予XOD處理，細胞自

8、噬通量明顯增加。
　　3．XOD、EBSS以及Rapamycin分別處理L-02細胞，2h、8h和24h后分別檢測自噬相關(guān)指標MDC染色、IF-LC3染色、LC3Ⅱ蛋白水平，以及細胞自噬小體數(shù)量的變化，結(jié)果顯示XOD較經(jīng)典自噬誘導劑各指標變化均更為明顯。
　　4．通過劑量篩選，一定劑量的t-BHP、PQ和XOD均可使L-02細胞LC3Ⅱ蛋白水平明顯升高，但在引起細胞自噬的同時，t-BHP和PQ可引起明顯的細胞凋亡或壞死，而X

9、OD處理組細胞存活狀態(tài)無明顯變化。
　　5．XOD處理細胞后，細胞內(nèi)總體ROS及線粒體ROS水平明顯升高。給予NAC或MitoQ處理后，Western Blot結(jié)果顯示自噬標志蛋白LC3Ⅱ水平明顯下降。此外，通過慢病毒轉(zhuǎn)染過表達抗氧化酶SOD2和/或CAT/M-CAT，各組ROS水平均有不同程度的降低，其中SOD2&CAT和SOD2&M-CAT共轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)總ROS以及線粒體 ROS水平均明顯降低，在此基礎上，XOD處理引起的LC

10、3Ⅱ蛋白水平也相應明顯降低。
　　6．XOD處理L-02細胞后，Western Blot結(jié)果顯示ROS相關(guān)信號通路AKT、p38/MAPK、ERK和AMPK以及自噬相關(guān)蛋白ULK1蛋白磷酸化水平顯著增加。聯(lián)合過表達SOD2&CAT和SOD2&M-CAT抗氧化蛋白后可以有效拮抗XOD處理引起的AKT、AMPK及ULK1蛋白磷酸化水平的升高。
　　7．抑制XOD誘導的自噬，細胞內(nèi)ROS和線粒體ROS水平及細胞的死亡程度均增加。<

11、br>　　8．XOD處理L-02細胞后，JC-1結(jié)果顯示線粒體膜電位降低，TEM觀察細胞內(nèi)有線粒體自噬現(xiàn)象，免疫熒光雙標發(fā)現(xiàn)LC3自噬熒光點與線粒體共定位，即發(fā)生了線粒體自噬，且熒光定量PCR檢測到線粒體DNA拷貝數(shù)明顯減少。
　　結(jié)論：
　　我們成功建立了XOD誘導L-02細胞的自噬模型，與常規(guī)自噬誘導劑相比該模型具有誘導效果明顯、易檢測及不伴隨凋亡或壞死等優(yōu)點。線粒體ROS在介導了此過程的發(fā)生，ROS通過信號通路AKT和