MX誘導(dǎo)L-02細(xì)胞ras基因活化及氧化應(yīng)激的研究.pdf

1、隨著我國人民生活水平的提高和社會老齡化，冠心病(coronaryheartdisease,CHD)的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢。如何降低CHD的發(fā)病率和死亡率成為公共衛(wèi)生和臨床醫(yī)學(xué)必須解決的一個重大問題。CHD是一種多基因、多步驟的疾病。各種研究表明，熱休克蛋白60(heatshcokprotein60，HSP60)抗原和抗體通過炎癥及免疫反應(yīng)在CHD的發(fā)生和發(fā)展過程中起非常重要的作用。 Hsp60是一種線粒體分子伴侶，在應(yīng)激條件

2、下表現(xiàn)出誘導(dǎo)性合成，保護(hù)細(xì)胞免受各種應(yīng)激的損傷。很多已知的CHD危險因素(氧化的低密度脂蛋白、高血壓、感染、氧化損傷等)可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞表達(dá)Hsp60，由于人和微生物Hsp60在氨基酸序列上有50-70％的同源性，針對于微生物Hsp60的免疫反應(yīng)可能和自身的Hsp60抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮的損傷。 Hsp60表達(dá)量或表達(dá)亞型上的變化，可以改變Hsp60的抗原性及機(jī)體對應(yīng)激因素的耐受性，進(jìn)而影響個體對CHD的

3、易感性。目前的研究表明編碼區(qū)及調(diào)控區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)可能改變蛋白質(zhì)表達(dá)的量或亞型，但很少有人研究hsp60SNPs意義及其在CHD發(fā)生和發(fā)展過程中的作用。 不同人種SNPs類型和頻率不同，美國國立生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)和歐洲生物信息學(xué)研究所(EuropeanBioinf

4、ormaticsInstitute，EBI)等公共數(shù)據(jù)庫收錄了60多個hsp60SNPs，其中6個為導(dǎo)致氨基酸改變的錯義SNPs，但這些SNPs缺乏頻率和人種信息。在中國漢族人群中進(jìn)行hsp60SNPs與CHD關(guān)聯(lián)研究必須首先明確hsp60SNPs在中國漢族人群中的種類、頻率和分布規(guī)律。 對中國漢族人群hsp60再測序，是解決上述問題的最佳方法。因此本研究通過hsp60再測序，找出中國漢族人中常見的SNPs，并從中選擇有代表性的

5、SNPs，采用病例對照研究分析hsp60基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系。 第一部分hsp60基因多態(tài)性在中國漢族人群中的分布 本部分應(yīng)用分片段擴(kuò)增直接測序結(jié)合Taqman基因分型技術(shù)，檢測30名健康志愿者的hsp60基因5'側(cè)翼區(qū)、全部編碼區(qū)、內(nèi)含子外顯子交界區(qū)序列，比較檢測結(jié)果和NCBI和EBI數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)數(shù)據(jù)，確定中國漢族人群hsp60基因SNPs的位置、類型和頻率。 結(jié)果顯示：1、研究人群中頻率大于1％的hsp

6、60SNPs共13個，其中4個為新發(fā)現(xiàn)SNPs。4個新SNPs分別是：位于2號染色體198189061的a/g(外顯子2)，198184890a/g(外顯子5)，198184774ag/--(內(nèi)含子5)，198180643ac/--(內(nèi)含子7)，雜合度分別為0.06、0.04、0.5、0.5；9個已報道的SNPs分別為r1116734g/c，rs3749095c/t，rs1050347t/c，rs8539a/g，rs2340690t/c

7、，rs3214832tttgagttatcttatgatcaaaag/-，rs7585486c/g，198180659a/c(無rs編號)，rs788016c/t；2、Rs1116734、rs1050347、rs8539、rs2340690、rs788016在不同人種中的分布均有顯著性差異(P=0.00)。3、連鎖不平衡分析后發(fā)現(xiàn)rs1116734與198189061a/g，rs1116734與rs788016不存在連鎖不平衡。rs10

8、50347、rs2340690、rs3214832、rs7585486及198180659a/c(無rs編號)兩兩間完全連鎖不平衡，rs8539，198184774ag/--、198180643ac/--兩兩間完全連鎖不平衡。其余位點間均為中度連鎖不平衡。4、以r2大小(r2=1)及最小等位基因頻率(≥5％)對13個SNPs進(jìn)行選擇，5個代表性SNPs位點rs1116734、rs3749095、rs8539、rs2340690、rs78

9、8016可構(gòu)成9種單倍型。 本部分結(jié)果表明中國漢族人群hsp60的SNPs分布有別于其他人種，rs1116734、rs3749095、rs1050347、rs8539、rs2340690、rs3214832、198184774ag/--、rs7585486、198180659a/c、198180643ac/--、rs788016是hsp60基因在中國漢族人群中較常見的SNPs。rs1116734、rs3749095、rs8539

10、、rs2340690、rs788016是五個較有代表性的SNPs。 第二部分hsp60基因多態(tài)性在冠心病中的作用 根據(jù)位點間D'值和SNPs頻率，從rs1116734、rs3749095、rs8539、rs2340690、rs788016中優(yōu)先選擇rs788016和rs2340690，應(yīng)用Taqman基因分型法在674名冠心病病例和744名對照中進(jìn)行hsp60SNPs基因型與冠心病危險度關(guān)系的研究。 結(jié)果顯示：r

11、s788016和rs2340690各基因型在冠心病組和對照組的分布無顯著性差異(P＞0.05)；按性別、年齡、吸煙狀況進(jìn)行分層后，在年齡小于60歲的男性冠心病患者中，hsp60基因rs788016GG基因型和rs2340690CC+CT基因型的頻率低于對照；rs788016AA+AG(相對于GG，OR：1.78，95％CI1.04-3.03)為該人群中冠心病發(fā)病的危險因素、rs2340690CC+CT(相對于TT，OR：0.58，95％

12、CI，0.62-5.20)為該人群中冠心病發(fā)病的保護(hù)因素，但分層分析表明基因型和冠心病發(fā)病無關(guān)。進(jìn)一步采用Logistic回歸模型排除其他混雜因素分析男性吸煙組中rs788016基因型與冠心病的關(guān)系，調(diào)整其他因素后，rs788016AA+AG基因型(相對于GG基因型)對CHD有較高的危險性：OR：1.74，95％CI：1.08-2.82。本部分結(jié)果提示在男性吸煙人群中，rs788016AA+AG基因型是冠心病發(fā)病的獨立危險因素。

13、 本研究的創(chuàng)新之處在于：(1)對中國漢族人群hsp60基因進(jìn)行了再測序，發(fā)現(xiàn)了4個新SNPs；(2)揭示了中國漢族人群hsp60SNPs間的連鎖關(guān)系，找出了hsp60基因有代表性的SNPs，推算出hsp60基因在中國漢族人群的中主要單倍型；(3)首次進(jìn)行了hsp60基因SNPs與冠心病關(guān)聯(lián)的研究，發(fā)現(xiàn)hsp60基因rs788016可能與冠心病發(fā)病生相關(guān)，攜帶rs788016GG基因型個體對冠心病易感性顯著降低。 本研究有待深入的