氧化應(yīng)激誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞microRNA表達(dá)譜的改變及驗證.pdf

1、目的:隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活方式的改變及老齡化進(jìn)程的加速，我國糖尿病(Diabetes mellitus，DM)患者的發(fā)病率正呈上升的趨勢，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy, DR)是DM微血管并發(fā)癥之一，長期慢性高血糖是其發(fā)病基礎(chǔ)，代謝、內(nèi)分泌及血液因素促其發(fā)生、發(fā)展。DR的發(fā)病機(jī)制主要有多元醇通路、蛋白激酶C活化、糖基化終產(chǎn)物形成及其受體活化、氨基己糖途徑和氧化應(yīng)激水平升高等

2、，其中氧化應(yīng)激水平升高是DR發(fā)病的早期事件及始動環(huán)節(jié)。因此，研究氧化應(yīng)激損傷在DR發(fā)病中的作用及分子機(jī)制對DR的早期防治具有重要意義。MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄后翻譯調(diào)控蛋白的表達(dá)。眾多研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激病理狀態(tài)下miRNAs表達(dá)譜改變并通過其作用靶點發(fā)揮重要的作用。但在氧化應(yīng)激致DR發(fā)病早期，miRNAs表達(dá)的改變及其對靶分子的調(diào)控機(jī)制尚不明了。自由基生成與

3、降解不平衡會導(dǎo)致活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平升高，從而增高氧化應(yīng)激水平，H2O2是體內(nèi)ROS的一種，并且血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是DR發(fā)病機(jī)制的一個重要特征。因此，我們的研究通過給予原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanumbilical vein endothelial cells，HUvECs) H2O2刺激制備氧化應(yīng)激細(xì)胞模型模擬DR早期病變，通過基因芯片技術(shù)檢測miRNAs表達(dá)譜的改變。挑選出差異

4、性表達(dá)miRNAs對其進(jìn)行Real-time PCR驗證，通過在線軟件預(yù)測其靶分子，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從而篩選出可能與氧化應(yīng)激致DR發(fā)生有關(guān)的miRNAs，不僅可以在基因水平上進(jìn)一步揭示在DR發(fā)病的機(jī)制，同時為DR的治療提供了全新的角度。
　　方法:原代HUVECs分離培養(yǎng):采用膠原酶灌注消化法分離HUVECs，接種至包被有多聚賴氨酸的25cm2的培養(yǎng)瓶中，24h后更換培養(yǎng)液，以后根據(jù)細(xì)胞生長情況更換培養(yǎng)液。當(dāng)原代細(xì)胞融合90

5、％以上后，加入0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA溶液消化，傳代培養(yǎng)。第四代內(nèi)皮細(xì)胞用于測定細(xì)胞活力及凋亡、壞死，并且收集細(xì)胞提取RNA進(jìn)行基因芯片篩選及Real-time PCR驗證。原代HUVECs的鑒定:應(yīng)用兔抗人Ⅷ因子單克隆抗體對第一代HUVECs進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定原代HUVECs。CCK-8法測定細(xì)胞活力:顯微鏡下觀察，將第四代HUVECs隨機(jī)分為5組，每組中分別加入0μM、100μM、200μM、400μM、500

6、μM、600μM、800μM的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)8、16、24小時，用CCK-8法測定細(xì)胞活力，觀察細(xì)胞損傷情況，選擇合適的H2O2刺激濃度及刺激時間。Annexin V-FITC/PI熒光染色檢測HUVECs凋亡及壞死率:將長至約70％的第四代HUVECs隨機(jī)分為2組，其中一組加入正常培養(yǎng)液，另一組加入含200μMH2O2的培養(yǎng)液，24 h后用Annexin V-FITC/PI熒光染色，流式細(xì)胞儀檢測HUVECs凋亡率及壞死率。提取細(xì)

7、胞總RNA送至杭州聯(lián)川生物科技有限公司進(jìn)行miRNAs基因芯片檢測:提取正常培養(yǎng)和200μMH2O2刺激24 h后的HUVECs總RNA送至杭州聯(lián)川生物科技有限公司檢測HUVECs miRNAs的表達(dá)譜。miRNAs生物信息學(xué)分析:根據(jù)miRNAs芯片結(jié)果、文獻(xiàn)中氧化應(yīng)激狀態(tài)下miRNAs表達(dá)的改變和在miRNAs在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)量篩選出25個可能與我們的研究相關(guān)的miRNAs，應(yīng)用DAVID軟件對miRNAs的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分

8、析。篩選與DR發(fā)病有關(guān)的miRNAs采用Real-timePCR方法進(jìn)行驗證。統(tǒng)計學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)采用(x)±s表示。用SPSS13.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用方差分析和獨立樣本t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1 HUVECs鑒定:兔抗人Ⅷ因子單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽性反應(yīng)物呈棕黃色，反應(yīng)物分布于內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。顯微鏡下觀察，第一代HUVECs胞體飽滿，呈梭形或多邊形，細(xì)胞表面光滑

9、，邊界清楚。
　　2細(xì)胞活力測定:不同濃度的H2O2刺激HUVECs不同時間后，細(xì)胞活力明顯降低(P＜0.01)，并且表現(xiàn)出一定的劑量和時間依賴性。
　　3 Annexin V-FITC/PI熒光染色檢測HUVECs凋亡及壞死:與正常培養(yǎng)的HUVECs比較，200μM H2O2刺激24 h后細(xì)胞凋亡與壞死明顯增多(P＜0.05)。
　　4 miRNAs芯片結(jié)果:與正常對照組相比，H2O2刺激組有40個差異表達(dá)的miRN

10、As(P＜0.05)，綜合考慮miRNAs芯片結(jié)果、文獻(xiàn)中氧化應(yīng)激狀態(tài)下miRNAs表達(dá)的改變、miRNAs在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)量及生物信息學(xué)分析的結(jié)果，我們的實驗選擇miR-638、miR-1246、miR-1275、miR-4267、miR-4324、miR-4734、miR-15b-5p進(jìn)行Real-time PCR驗證。
　　5生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:這些差異性表達(dá)的miRNAs參與了細(xì)胞凋亡、蛋白的泛素化及磷酸化、2型糖尿

11、病、鈣離子通道的轉(zhuǎn)運(yùn)、血管平滑肌的收縮、神經(jīng)營養(yǎng)因子轉(zhuǎn)運(yùn)、胰島素信號通路、癌癥抑制與生成等多個生物學(xué)過程，其中21個miRNAs的33個靶基因(包括miR-4267)參與了凋亡的信號通路過程。
　　6差異性表達(dá)miRNAs的驗證:結(jié)果顯示，miR-638、miR-1246、miR-4267在HUVECs H2O2刺激組表達(dá)明顯上調(diào)與芯片結(jié)果大致相同。
　　7對miR-4267進(jìn)行GO分析，結(jié)果顯示:miR-4267的靶基因主