自噬對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞和正常肝L-02細(xì)胞作用的差異及相關(guān)分子機(jī)制.pdf

1、背景：腫瘤在當(dāng)今世界的全球死亡原因中位居第二位。原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepato-cellular carcinoma，HCC）惡性程度高，發(fā)展迅速，容易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，使大部分患者在就診時(shí)已經(jīng)是晚期，失去了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，而且肝癌對(duì)化療亦不敏感。故只有通過對(duì)于癌癥的發(fā)生及其發(fā)展機(jī)制的不斷深入研究，才能取得更有效的預(yù)防和治療方法。
　　在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，由各種原因引起的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊及錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的積累，被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplas

2、mic reticulum stress,ERS）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激刺激過強(qiáng)，除了可以導(dǎo)致細(xì)胞經(jīng)凋亡途徑死亡外，還可以經(jīng)II型程序性死亡方式－自噬。自噬是由基因調(diào)控并在進(jìn)化上保守的介導(dǎo)的細(xì)胞自我消化的途徑，充當(dāng)腫瘤發(fā)生的動(dòng)態(tài)監(jiān)管機(jī)制。自噬對(duì)細(xì)胞的分化和發(fā)育起至關(guān)重要的作用，它是細(xì)胞對(duì)惡劣環(huán)境及壓力的一種反應(yīng)，但其對(duì)細(xì)胞生存的意義并不清楚。
　　ERS的發(fā)生可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。BCL-2是從人類復(fù)發(fā)性濾泡性淋巴瘤染色體易位的斷點(diǎn)區(qū)被確定的凋亡

3、基因。Bcl-2家族蛋白不僅參與I型程序性細(xì)胞死亡（即凋亡），還參與了II型程序性死亡（即自噬）的調(diào)控。細(xì)胞自噬可防止抗腫瘤藥誘導(dǎo)的凋亡，促進(jìn)腫瘤耐藥。然而，自噬性細(xì)胞死亡可能是凋亡耐受腫瘤細(xì)胞的一種死亡方式。本實(shí)驗(yàn)主要探索在ERS狀態(tài)下，自噬對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞及肝正常L-02細(xì)胞作用的差異，及通過對(duì)Bcl-2基因的研究，了解凋亡與自噬的關(guān)系，以期能夠?yàn)樘岣吒伟┲委熜Ч麑ふ倚碌牟呗浴?br>　　第一部分觀察自噬抑制劑在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下

4、對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞和正常肝L-02細(xì)胞作用的差異
　　目的：觀察自噬在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）狀態(tài)下對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L-02作用的差異。
　　方法：體外常規(guī)培養(yǎng)的人肝癌 HepG2細(xì)胞和正常肝 L-02細(xì)胞，分別給予衣霉素(TM)單藥和TM聯(lián)合自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(TM+3-MA)或氯喹(TM+CQ)作用12、24、48 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blot

5、法檢測(cè)自噬蛋白LC3、抗凋亡蛋白Bcl-2的變化。
　　結(jié)果：TM可引起HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞死亡并呈時(shí)間依賴關(guān)系，3-MA或CQ均可增加TM對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，24 h細(xì)胞存活率分別為TM+3-MA(60％)、TM+CQ(72%)、TM(86%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但對(duì)于L-02細(xì)胞，其存活率分別為83%、84%、83%，活力沒有明顯差異；Annexin V/PI凋亡實(shí)驗(yàn)顯示TM+3-MA、TM

6、+CQ和TM組對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡率分別為15%、11%和7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但對(duì)L-02細(xì)胞組，凋亡率分別為16%、17%、16%，未見明顯差別；免疫印跡結(jié)果顯示 TM引起自噬增加，自噬抑制劑3-MA與CQ可引起兩種細(xì)胞自噬作用減弱；同時(shí)，在HepG2細(xì)胞中，加入自噬抑制劑后，Bcl-2基因表達(dá)下調(diào)，而在L-02細(xì)胞中，Bcl-2基因低表達(dá)且未見明顯變化。
　　結(jié)論：自噬抑制劑(或3-MA或CQ)均可顯著增

7、加TM對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，但對(duì)正常肝L-02細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在HepG2細(xì)胞中，加入自噬抑制劑后，Bcl-2基因表達(dá)下調(diào)，而在L-02中未見明顯差異。因此，可以認(rèn)為自噬在 ERS狀態(tài)下可對(duì)癌細(xì)胞的生存提供保護(hù)，但對(duì)正常細(xì)胞無保護(hù)作用；同時(shí)，Bcl-2基因或是導(dǎo)致這一差異的分子機(jī)制之一。
　　第二部分初步探討B(tài)cl-2基因或是自噬對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞提供生存保護(hù)的分子機(jī)制之一
　　目的：研究在E

8、RS狀態(tài)下，因Bcl-2基因在肝癌HepG2細(xì)胞和正常肝細(xì)胞L-02中表達(dá)的差異，導(dǎo)致自噬可為肝癌HepG2細(xì)胞提供生存保護(hù)。
　　方法：體外常規(guī)培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞和正常肝L-02細(xì)胞，給以Bcl-2的siRNA敲除Bcl-2基因，設(shè)空白對(duì)照組，NC+TM組，siRNA+TM組，單藥TM組分別作用24h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blot法檢測(cè)抗調(diào)亡蛋白Bcl-2的變化。

9、>　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)Bcl-2的基因后，MTT結(jié)果顯示：HepG2細(xì)胞中，siRNA+TM組細(xì)胞存活率為70%，較TM單藥組細(xì)胞存活率（88%）顯著下降，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；L-02細(xì)胞組中siRNA+TM組細(xì)胞存活率為86%，與TM單藥組細(xì)胞存活率（81%）相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式結(jié)果顯示：siRNA+TM組作用HepG2細(xì)胞24 h后，HepG2細(xì)胞凋亡率（11.17%）顯著高于TM組（7.78%），

10、差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而 L-02組24 h，各實(shí)驗(yàn)組間凋亡率（NC:19.60%、siRNA+TM:19.45%、TM:19.89%）未見明顯差異。Western blot法檢測(cè)顯示：HepG2細(xì)胞組中，轉(zhuǎn)染組Bcl-2/actin的灰度比值較TM單藥組顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而L-02細(xì)胞組中，幾乎未見Bcl-2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：在TM誘導(dǎo)ERS狀態(tài)作用下，用siRNA下調(diào)Bcl-2