氫醌對(duì)L-02型人正常肝細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響.pdf

1、氫醌(Hydroquinone，HQ)又名對(duì)苯二酚(C6H6O2)，在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，日常生活中通過(guò)某些藥物、化妝品也可長(zhǎng)時(shí)間接觸。HQ還是苯的代謝物之一，在苯毒性效應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。其主要職業(yè)接觸人群為氫醌或者苯的生產(chǎn)工人，照相顯影操作工，橡膠、塑料穩(wěn)定劑操作工等。HQ經(jīng)消化道、呼吸道和皮膚吸收，廣泛分布于各臟器組織，主要在肝內(nèi)代謝，大部分與葡萄糖醛酸或硫酸鹽形成結(jié)合物，經(jīng)尿排出而解毒；部分富集于骨髓組織，再進(jìn)一步代謝生成對(duì)苯半

2、醌和對(duì)苯醌。HQ在體內(nèi)代謝活化產(chǎn)生一系列毒害反應(yīng)，危害人類(lèi)尤其是職業(yè)接觸者的健康。人群流行病學(xué)調(diào)查及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究均發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期接觸HQ可對(duì)肝、腎、骨髓造血系統(tǒng)等造成損傷，表現(xiàn)為血細(xì)胞數(shù)量減少，肝腎重量增加等；而且還揭示其HQ潛在致癌性，表現(xiàn)為肝細(xì)胞腺瘤、腎小管細(xì)胞腺瘤等。HQ對(duì)人體的毒害作用以視覺(jué)系統(tǒng)較為敏感，引起視力下降，眼結(jié)膜和角膜的損傷。此外還可引起皮膚刺激反應(yīng)，長(zhǎng)期接觸可導(dǎo)致外源性黃褐病。 關(guān)于HQ毒作用機(jī)制的研究顯示，HQ

3、可以導(dǎo)致DNA損傷、染色體畸變、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖等，但是這些研究局限于人為地選取一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析，不能從整體水平上對(duì)HQ的毒作用機(jī)制作出較為系統(tǒng)的解釋?zhuān)阴r見(jiàn)蛋白質(zhì)水平的研究。近年來(lái)，基因組研究由結(jié)構(gòu)基因組轉(zhuǎn)為功能基因組，高通量掃描技術(shù)(包括基因組和蛋白質(zhì)組分析技術(shù))已被引入職業(yè)病研究領(lǐng)域。這些技術(shù)可以從基因組或蛋白質(zhì)組水平揭示外界刺激對(duì)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，“中性”地反映該因素的生物學(xué)效應(yīng)，為作用機(jī)制的

4、探討提供新的思路。為此，本學(xué)位論文計(jì)劃采用蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)研究HQ刺激后人肝細(xì)胞蛋白質(zhì)譜的表達(dá)變化，以期發(fā)現(xiàn)可能的HQ毒作用敏感反應(yīng)蛋白質(zhì)，從蛋白質(zhì)組學(xué)角度探索HQ毒作用機(jī)制，并為HQ接觸者職業(yè)病的診斷和防治及進(jìn)一步完善HQ的職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)資料。 為實(shí)現(xiàn)以上目的，我們首先使用雙向凝膠電泳技術(shù)分離蛋白。體外傳代培養(yǎng)的L-02型肝細(xì)胞分2組，處理組經(jīng)HQ(濃度為1×10-4mol/L)染毒24h，對(duì)照組不做處理。

5、然后同時(shí)提取蛋白進(jìn)行雙向凝膠電泳，一向采用IPG17cm，pH5-8的膠條，二向使用12％的SDS-PAGE凝膠。電泳后的凝膠用銀染方法進(jìn)行染色，并用GS800掃描儀掃描，圖譜經(jīng)PDQuest7.1軟件分析，建立化學(xué)物質(zhì)HQ實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞蛋白質(zhì)差異表達(dá)圖譜。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次，每次實(shí)驗(yàn)處理組和對(duì)照組各設(shè)3塊膠作為組內(nèi)重復(fù)。結(jié)果顯示，每塊膠檢測(cè)到1000個(gè)左右的蛋白點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組凝膠匹配率組內(nèi)達(dá)90％以上，組間80％以上，3次實(shí)驗(yàn)

6、各發(fā)現(xiàn)17、18、24個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)改變，表達(dá)量上調(diào)或者下調(diào)2倍及以上，其中4個(gè)蛋白點(diǎn)在3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中均出現(xiàn)。然后切取這4個(gè)重復(fù)性較好的差異蛋白點(diǎn)，用特異性的胰酶膠內(nèi)消化，酶解后的肽段采用Voyager-DESTRMALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析。把得到的蛋白質(zhì)各肽段質(zhì)荷比經(jīng)過(guò)胰酶自切峰作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正，再去除污染峰、酶切峰等，綜合所得肽段信息使用Mascot搜索NCBI人類(lèi)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，誤差為100ppm。4個(gè)蛋白

7、分別是RhoGDP解離抑制蛋白(RhoGDPdissociationinhibitorGDIalpha)，6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯酶(6-phosphogluconolactonase)，erbB3結(jié)合蛋白EBP1(erbB3bindingproteinEBP1)和核纖層蛋白(laminA/C，isoform1precursor)。這些蛋白與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡及能量代謝等密切相關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證雙向凝膠電泳和質(zhì)譜鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們選取蛋白E

8、BP1使用傳統(tǒng)方法WesternBlot進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明HQ處理后肝細(xì)胞內(nèi)EBP1蛋白表達(dá)下調(diào)，與上述方法得到的結(jié)果一致。 綜上所述，我們認(rèn)為，HQ作為一種職業(yè)危害因素可以引起肝細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化，是其發(fā)生毒性效應(yīng)機(jī)制之一。實(shí)驗(yàn)中鑒定到的數(shù)個(gè)蛋白與血液系統(tǒng)損傷有著直接或者間接的聯(lián)系，但是這些蛋白在血液系統(tǒng)細(xì)胞中的表達(dá)情況尚待研究。運(yùn)用雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜分析的方法能有效分離鑒定暴露于HQ后肝細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，方法可行，結(jié)