曲古霉素A在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中通過(guò)誘導(dǎo)自噬減少細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分自噬相關(guān)基因5在卵巢腫瘤病人中的表達(dá)及對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3增殖影響的意義研究
　　目的：檢測(cè)卵巢腫瘤中自噬相關(guān)基因5（Atg5）的表達(dá)情況，公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析 Atg5在mRNA表達(dá)水平的與患者預(yù)后的相關(guān)性。研究人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中Atg5下調(diào)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　方法：收集各種類型卵巢腫瘤病人卵巢腫瘤標(biāo)本共30例，切取標(biāo)本石蠟包埋并對(duì)其進(jìn)行Atg5抗體的免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)Atg5在不同卵巢腫瘤病人中的表

2、達(dá)情況。應(yīng)用公共數(shù)據(jù)庫(kù)Kaplan-Meier plots對(duì)多組卵巢癌病人mRNA表達(dá)譜分析，預(yù)測(cè)Atg5的表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的影響。SKOV3細(xì)胞分為兩組，陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染Atg5 siRNA)。通過(guò)蛋白印記法檢測(cè)、CCK-8法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后Atg5的表達(dá)及增殖情況。
　　結(jié)果：免疫組織化學(xué)檢測(cè)卵巢腫瘤組織Atg5蛋白表達(dá)情況，卵巢癌組陽(yáng)性率（75％）較交界性卵巢腫瘤（4

3、0%）及良性卵巢腫瘤（20%）表達(dá)水平高，且卵巢癌與良性卵巢腫瘤組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。公共數(shù)據(jù)庫(kù)Kaplan-Meier plots表達(dá)譜芯片分析Atg5 mRNA水平表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示高表達(dá)Atg5組較低表達(dá)組預(yù)后差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=3.1e-05，HR=1.37（1.18-1.58））。對(duì)人類卵巢癌細(xì)胞系SKOV3進(jìn)行反義siRNA干擾，選取有封閉效應(yīng)的細(xì)胞采用CCK8法分別在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，陰性對(duì)

4、照組和轉(zhuǎn)染Atg5 siRNA組（實(shí)驗(yàn)組）A450值在24、48、72小時(shí)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組A450值分別為1.179±0.036、1.454±0.040、1.828±0.059；0.640±0.039、1.032±0.0541.146±0.040，實(shí)驗(yàn)組較陰性對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：免疫組織化學(xué)法檢測(cè) Atg5在卵巢癌中表達(dá)與良性腫瘤及交界性卵巢腫瘤相比明顯升高，對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)mRNA表達(dá)譜芯片的分析顯示，Atg

5、5高表達(dá)可能與卵巢癌的不良預(yù)后有關(guān)，反義干擾siRNA顯著下調(diào)了Atg5蛋白水平表達(dá)的SKOV3細(xì)胞，其增殖能力受到明顯抑制。
　　第二部分TSA在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中通過(guò)誘導(dǎo)自噬減少細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
　　目的：通過(guò)觀察研究TSA對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、自噬及產(chǎn)生ROS的情況，探討其作用機(jī)制。
　　方法：應(yīng)用western blot法檢測(cè)TSA作用后卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中PARP，Atg5，Bcl-2，LC3B

6、等蛋白表達(dá)水平的變化；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TSA作用于卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中引起的細(xì)胞凋亡,細(xì)胞ROS產(chǎn)生情況及變化；觀察細(xì)胞熒光的方法檢測(cè)TSA作用于過(guò)表達(dá)LC3-GFP的SKOV3細(xì)胞系中LC3-GEP熒光點(diǎn)的產(chǎn)生、分布和聚集情況。
　　結(jié)果： GFP-LC3的SKOV3細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨著TSA加藥濃度的增加而增加，自噬細(xì)胞的比例逐漸增加。Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Atg5、LC3B的表達(dá)水平隨時(shí)間的增加，提示自噬

7、水平增加。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)TSA處理被MitoSOX-Red標(biāo)記的細(xì)胞，熒光強(qiáng)度增加，提示TSA可以誘導(dǎo)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。當(dāng)TSA與自噬抑制劑氯喹（CQ）聯(lián)用時(shí)，細(xì)胞較單加TSA時(shí)細(xì)胞GFP-LC3熒光點(diǎn)顯著減少，自噬細(xì)胞比例明顯降低。Atg5表達(dá)水平下降，而凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平增高，同時(shí)流失細(xì)胞數(shù)測(cè)得凋亡率增加，提示自噬水平降低同時(shí)凋亡水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而當(dāng) TSA與抗氧化劑 N-乙酰半胱氨酸(NAC)聯(lián)用時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

8、 ROS水平被顯著抑制，此時(shí)細(xì)胞自噬水平較單加TSA組顯著被制而凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論： TSA可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生及自噬和凋亡水平的增加。TSA處理的細(xì)胞中，抑制細(xì)胞內(nèi)自噬水平時(shí)凋亡水平隨之增加，當(dāng)抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)自噬水平降低同時(shí)凋亡水平增加。提示TSA誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS可以使細(xì)胞內(nèi)保護(hù)性自噬增加，從而使細(xì)胞的凋亡率降低，抑制ROS的產(chǎn)生可以降低自噬水平，使細(xì)胞凋亡率增加。TSA作為一種新型