奇果菌素誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬形式死亡及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　卵巢癌(ovarian cancer，OC)在婦科惡性腫瘤中病死率高居首位，發(fā)病率僅次于宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌，其中上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)比例約85％～90％。由于早期卵巢癌（FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期）無明顯的臨床癥狀和體征，多數(shù)卵巢癌患者在初診時(shí)已發(fā)展為晚期（FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期），伴有腹脹、腹水、腹腔癌灶播散種植等癥狀。上皮性卵巢癌的經(jīng)典治療方案以手術(shù)為主，術(shù)后

2、輔以鉑類為基礎(chǔ)的化療等綜合治療。絕大多數(shù)進(jìn)展期病人（約70％～80％）在治療后最終會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其5年總生存率較低（約30％～40％）。另外術(shù)后化療等綜合治療有較大的副作用，如惡心、嘔吐、骨髓抑制、疲乏、脫發(fā)等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，并在一定程度上阻礙了術(shù)后輔助治療的進(jìn)展，甚至很多患者出現(xiàn)鉑類耐藥等現(xiàn)象。因此，尋找新型的、有效的以及毒副反應(yīng)低的抗卵巢癌藥物，對(duì)提高其治療的有效率、改善其預(yù)后及逆轉(zhuǎn)卵巢癌化療耐藥等是十分有必要的。奇果

3、菌素(Grifolin，2-trans，trans-farnesyl-5-methylresorcinol)，是一種從可食用的美洲蘑菇菌類地花菌(Albatrellus confluens)中萃取出來的次代代謝產(chǎn)物，類屬于擔(dān)子菌類。最初奇果菌素被驗(yàn)證具有降低血漿膽固醇濃度的功能，隨后大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)其強(qiáng)效的抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗癌活性，其中抗癌機(jī)制被廣泛深入研究，已有研究發(fā)現(xiàn)奇果菌素發(fā)揮抗癌活性的機(jī)制包括抑制癌細(xì)胞的增殖、阻滯細(xì)胞周期、

4、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞黏附、侵襲及遷移等。但在上皮性卵巢癌中抗癌活性及其機(jī)制尚未見報(bào)道。本文旨在研究奇果菌素對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和SK-OV-3增殖、自噬等能力的影響并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　研究方法:
　　1.MTT法檢測(cè)不同濃度奇果菌素作用A2780和SK-OV-3兩種細(xì)胞不同時(shí)間的生存率。
　　2.流式細(xì)胞學(xué)吖啶橙染色法檢測(cè)自噬囊泡、熒光顯微鏡下GFP-LC3自噬小體集合法、電鏡檢測(cè)自噬體等方

5、法驗(yàn)證奇果菌素對(duì)A2780和SK-OV-3細(xì)胞系的自噬作用。
　　3.Western-blot法、免疫熒光法檢測(cè)奇果菌素對(duì)A2780和SK-OV-3細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白分子的表達(dá)量以及自噬相關(guān)的Akt/mTOR/S6K信號(hào)通路中靶蛋白分子表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　4.應(yīng)用自噬抑制劑氯喹及敲除自噬靶點(diǎn)分子LC3B，通過MTT法、流式細(xì)胞技術(shù)及Western-blot法反向證明奇果菌素對(duì)A2780細(xì)胞和SK-OV-3細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)作用。<

6、br>　　應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS18.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，P＜0.05統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)過三次不同實(shí)驗(yàn)所得，用平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。
　　研究結(jié)果:
　　1.奇果菌素可以抑制卵巢癌細(xì)胞增殖能力:MTT法檢測(cè)奇果菌素作用前后A2780和SK-OV-3細(xì)胞的生長(zhǎng)率，結(jié)果顯示:奇果菌素對(duì)兩種細(xì)胞系均有抑制增殖作用，表現(xiàn)出濃度梯度和時(shí)間梯度差異（P＜0.05）。
　　2.奇果菌素可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬作用:流式細(xì)胞

7、學(xué)吖啶橙染色法、GFP-LC3小體集合試驗(yàn)、電子顯微鏡拍攝自噬體等結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，奇果菌素作用的兩種細(xì)胞系均檢測(cè)到自噬的發(fā)生。Western-Blot法檢測(cè)自噬相關(guān)靶點(diǎn)分子蛋白表達(dá)量、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)LC3B分子的熒光表達(dá)量，結(jié)果顯示LC3B、Atg7、Beclin-1上調(diào)，P62下調(diào);LC3B熒光亮度上調(diào)，驗(yàn)證了上述結(jié)果。反向驗(yàn)證法，聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑氯喹、敲除LC3B分子，MTT法檢測(cè)生存率、流式細(xì)胞術(shù)吖啶橙染色法檢測(cè)自噬囊

8、泡形成、Western-blot法檢測(cè)敲除LC3B前后的A2780細(xì)胞和SK-OV-3細(xì)胞的自噬作用，進(jìn)一步證實(shí)奇果菌素可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬作用，上述結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3.Western-blot法檢測(cè)奇果菌素誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系自噬形式死亡相關(guān)信號(hào)通路:結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，奇果菌素刺激后的細(xì)胞系表現(xiàn)出通路靶點(diǎn)分子磷酸化形式的蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.奇果