人CYP2B6酵母表達系統(tǒng)的建立及其多態(tài)性在體外代謝和藥物篩選中的研究.pdf

1、細胞色素P450286(CYP286)屬于人類細胞色素P450藥物代謝酶系，是CYP2B亞家族的成員。CYP450參與催化多種生物轉化反應，其中大多數是氧化反應，參與了許多內源和外源化合物的代謝[1]。CYP286在肝臟中的表達量約占到人類肝臟CYP450總量的5％，但是參與了將近7％的非常重要的臨床藥物的代謝[2，3]。代表性的藥物有抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺，他莫昔芬；麻醉藥異丙酚；抗抑郁藥安非他酮；丙咪嗪和非核苷類逆轉錄酶抑制劑依法韋侖等

2、等。種族、性別、年齡等都是可能對CYP286表達和活性產生影響的因素，然而導致CYP286藥物代謝差異性的最根本原因是基因多態(tài)性。 本研究中，我們挑選了CYP286*1（野生型）和四株分布頻率較高的CYP286多態(tài)性等位基因(CYP286*4，CYP286*6，CYP286*9和CYP286*13)作為研究對象，目的是建立一個穩(wěn)定的重組酶酵母表達系統(tǒng)和高通量熒光檢測技術平臺，來檢測CYP286多態(tài)性重組酶的體外代謝活性，研究不同

3、等位基因對藥物體外代謝的影響。在此基礎上利用該平臺對9類共22種臨床常用藥物進行體外篩選，這可以作為將來預測藥物體內代謝的重要參考依據。 實驗中克隆了CYP286*1和它的四個多態(tài)性等位基因。通過對商品化的質粒做PCR擴增得到CYP286*1 cDNA(1，5kb)，然后將這段基因克隆到穿梭質粒載體pYES2/CT中，可在酵母中誘導表達。以得到的CYP286*1 cDNA作為模板，通過定點突變的方法引入單核苷酸突變。CYP286

4、多態(tài)性等位基因在整合有人CYP450氧化酶基因的釀酒酵母中共表達。Western blot鑒定目的蛋白。以Vivid(R) BOMCC為熒光底物檢測CYP286酶活性，計算酶促反應動力學參數Km，Vmax和Vmax/Km。通過將熒光底物BOMCC(濃度在表觀Km值附近)，待檢藥物(濃度梯度為從128到0.0625μM2倍比稀釋)以及其他用來模擬體內生理環(huán)境的相關組分混合，以酶啟動反應來進行體外抑制實驗，分析待檢藥物對CYP286多態(tài)性酶

5、的抑制效應，并計算其半數抑制濃度。共對22種藥物進行了高通量藥物抑制實驗篩選。最后，我們成功地建立了穩(wěn)定的人CYP286異源表達系統(tǒng)和體外酶學分析及高通量藥物篩選平臺。 如同Western blot的結果所示，CYP286多態(tài)性酶在該系統(tǒng)中得到穩(wěn)定表達，成功獲得目的微粒體蛋白。通過對CYP286多態(tài)性酶的體外酶促反應動力學檢測實驗可得，CYP286.1代謝BOMCC的酶促反應動力學參數Km，Vmax，和Vmax/Km分別為18.

6、67±3.4μM，4.06±0.76 nmol/min/mg和0.22±0.06 mL/min/mg。本實驗所得數據和已報道的結果接近[68]。對CYP286的酶促反應動力學參數進行比較發(fā)現，對于Km值，CYP286.6＜.1＜.9＜.13＜.4，對于Vmax，CYP286.4＜.6＜.13＜.9＜.1，清除率則是CYP286.4＜.6＜.13＜.9＜.1.CYP286.4，．6和．13相對于野生型CYP286.1存在非常顯著的差異(p

7、＜0.01)。體外抑制實驗表示抗抑郁藥(舍曲林，氟伏沙明，反苯環(huán)丙胺)，抗癌藥(噻替派，雷洛昔芬)和酮康唑，噻氯匹定對CYP286.1的抑制效應很強。待檢藥物對CYP286的IC50值接近已報道的數據[82]。這些對CYP286多態(tài)性酶有抑制的檢測藥物對于不同等位基因的抑制效應不同，但是差距并不顯著。值得注意的是，有的藥物對CYP286及其多態(tài)性酶的抑制情況差異非常顯著，例如奎尼丁，氟西汀，氯米帕明，阿米替林和他莫昔芬，較強地抑制All