重組人CYP2D6的體外表達、活性研究及其在藥物篩選中的初步應(yīng)用.pdf

1、人細(xì)胞色素2D6是藥物代謝酶P450家族中一種重要的成員，也是最具多態(tài)性的CYP酶之一，其基因的多態(tài)性導(dǎo)致酶活性的增高，降低或者喪失，在表型上表現(xiàn)為弱代謝，中間代謝與強代謝三種。CYP2D6在肝臟中的含量不到5％，但臨床上常用藥物近30％由此酶代謝。本研究克隆CYP2D6野生株州ld type，WT)及五個單核苷酸突變株(single nucleotide polymorphisms，SNPs)A237S，E418Q，R343G T10

2、71和V11M的cDNA到半乳糖可誘導(dǎo)的表達載體pYES2/CT中，利用釀酒酵母表達重組酶，通過免疫印跡雜交驗證目的蛋白表達，進而用CYP2D6的傳統(tǒng)探針底物丁呋洛爾和相對特異性的熒光底物AMMC檢測重組酶的活性，比較不同SNPs與WT‘在代謝這兩種底物的酶動力學(xué)方面的差異，并利用高通量的熒光檢測技術(shù)對23種藥物進行抑制篩選。成功地建立了穩(wěn)定的P450酶的異源表達系統(tǒng)，初步搭建了在體外利用重組P450酶進行藥物代謝研究的平臺。

3、通過PCR方法從商品化的質(zhì)粒中獲得CYP2D6野生株的cDNA(全長約為1.5kbp)，克隆到半乳糖可誘導(dǎo)的表達載體pYES2/CT中。以野生株的eDNA為模板，利用PCR定點突變的方法引入單核苷酸突變位點，由此獲得五株SNPs的eDNA。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pYES2/CT-CYP2D6及其五株SNPs轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，誘導(dǎo)表達重組酶蛋白，通過Westernblotting驗證目的蛋白表達。 在驗證目的蛋白得到表達之后，大量誘導(dǎo)

4、重組CYP2D6蛋白，通過機械裂解法破碎酵母細(xì)胞，進一步通過差速離心法獲得蛋白微粒體。利用Bradford assay測定微粒體中的蛋白含量。 取適量微粒體蛋白與CYP2D6相對特異性熒光底物AMMC及傳統(tǒng)的探針底物丁呋洛爾分別進行酶動力學(xué)反應(yīng)，通過熒光檢測技術(shù)與高效液相色譜方法分析，反應(yīng)在產(chǎn)物的生成量與酶濃度及反應(yīng)時間都成線性的條件下進行。 利用熒光檢測技術(shù)篩查了抗抑郁藥等8類23種藥物，其中抗抑郁藥物氟西汀，舍曲林，

5、氯丙咪嗪，阿米替林和抗精神病類藥物氯丙嗪，硫利達嗪對CYP2D6的野生株及突變株都表現(xiàn)出較強的抑制作用；抗糖尿病藥和降膽固醇類藥物對CYP2D6都無抑制作用；同一種藥物對不同SNPs的抑制程度不盡相同。用HPLC分析了上述23種藥對CYP2D6野生株催化代謝丁呋洛爾的抑制情況，結(jié)果表明這些藥物對兩種底物的作用基本是一致的。 本研究成功地克隆了CYP2D6野生株及5個單核苷酸突變株的eDNA，并構(gòu)建了酵母表達體系。利用高通量的熒光