重組人促卵泡激素的體外活性研究.pdf

1、對重組人促卵泡激素（rhFSH）的活性研究需要建立基于細(xì)胞株的準(zhǔn)確、快速、簡便的體外活性測定方法，本研究開發(fā)建立了以KGN為基質(zhì)細(xì)胞測定rhFSH體外生物活性的方法。KGN細(xì)胞是一種人卵巢腫瘤顆粒細(xì)胞株，天然表達(dá)人促卵泡激素受體（hFSHR），當(dāng)rhFSH與位于靶細(xì)胞膜上的hFSHR結(jié)合后，激發(fā)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的信號傳導(dǎo)通路，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄激活目的基因表達(dá)，激活芳香化酶（ARO），進(jìn)而引起類固醇甾體如孕酮（progesterone）、雌

2、二醇（estradiol）等的合成和分泌。
　　本研究建立的體外活性測定法系采用不同濃度的rhFSH與KGN細(xì)胞表面的hFSHR結(jié)合，刺激細(xì)胞產(chǎn)生不同濃度的孕酮并分泌到胞外，再用商品化的孕酮檢測的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒測定培養(yǎng)上清中孕酮含量來評價(jià)rhFSH的生物學(xué)活性。KGN細(xì)胞對rhFSH呈明顯劑量反應(yīng)關(guān)系，測定結(jié)果用第二代rhFSH活性測定用國際標(biāo)準(zhǔn)品（NIBSC code:08/282）進(jìn)行校正；采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)

3、板，考察不同的KGN細(xì)胞鋪板密度、rhFSH作用時(shí)間、rhFSH濃度范圍等，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件為：KGN細(xì)胞鋪板密度為2×104個/孔，rhFSH最佳作用時(shí)間為72小時(shí)，rhFSH作用的最佳濃度范圍為0.1ng/mL～200ng/mL。對專屬性、線性與范圍、回收率、精密度、耐用性等進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示KGN細(xì)胞對FSH有很好的劑量反應(yīng)關(guān)系，專屬性符合要求；線性范圍為0.1ng/mL～200ng/mL，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99；回收率為8

4、0％～120%；3批市售樣品和3批自制樣品經(jīng)3次重復(fù)測定，活性分別為13.4±0.4IU/μg～13.5±0.8IU/μg和12.9±0.7IU/μg～14.3±1.2IU/μg之間，變異系數(shù)在15%之內(nèi)；采用不同品牌市售孕酮檢測ELISA試劑盒測定方法耐用性，結(jié)果顯示不同試劑盒結(jié)果無顯著性差異，耐受性良好。測定了3批市售rhFSH產(chǎn)品和1批尿源FSH國家標(biāo)準(zhǔn)品，體外活性測定結(jié)果與傳統(tǒng)動物體內(nèi)活性測定結(jié)果一致。該方法使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板

5、可以同時(shí)進(jìn)行多個樣品的檢測，與大鼠卵巢增重法(Steelman-Pohley法)相比，可顯著提高檢測效率，降低檢測成本。利用KGN細(xì)胞建立的rhFSH的體外活性測定法具有很高的檢測準(zhǔn)確度、靈敏度、精密度及良好的耐用性，檢測效率高，有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的動物體內(nèi)活性測定方法，用于對rhFSH生物學(xué)活性的研究和評價(jià)。
　　為進(jìn)一步確認(rèn)KGN細(xì)胞對rhFSH應(yīng)答的專一性，以及rhFSH對細(xì)胞表面hFSHR的親和力大小，本研究選擇一種商品化的市售

6、抗hFSHR抗體（Human FSH R Antibody，R&D)與KGN細(xì)胞提前孵育，使抗hFSHR抗體與細(xì)胞表面hFSHR結(jié)合，然后向細(xì)胞培養(yǎng)液中再加入rhFSH，作用72h后，檢測上清中孕酮含量的增加情況，確定抗hFSHR抗體對細(xì)胞表面hFSHR的中和作用；對不同批次自制品和原研品進(jìn)行比對，確認(rèn)其對FSHR的親和力是否一致。結(jié)果顯示在rhFSH濃度為10ng/mL（0.3nM）時(shí)，抗hFSHR抗體的中和活性ND50為1.84×1

7、03ng/mL(12nM)，rhFSH濃度為70ng/mL（2.1nM）時(shí)，抗hFSHR抗體的中和活性ND50為1.52×104ng/mL（100nM）。該結(jié)果說明且抗hFSHR抗體可以和細(xì)胞表面hFSHR結(jié)合從而抑制rhFSH與其結(jié)合，但無法像rhFSH一樣激活細(xì)胞內(nèi)第二信使的反應(yīng)，且rhFSH對hFSHR的親和力遠(yuǎn)高于抗hFSHR抗體。實(shí)驗(yàn)中還選用了一個無關(guān)抗體（抗人促血小板生成素模擬肽-Fc融合蛋白抗體，簡稱抗TMP-Fc抗體）作

8、為陰性對照，結(jié)果顯示抗TMP-Fc不能阻斷FSH和受體的結(jié)合，說明抗hFSHR抗體和hFSHR的結(jié)合具有特異性。
　　比較不同來源和批次rhFSH樣品在抗hFSHR抗體存在時(shí)的活性變化情況，確認(rèn)其與hFSHR親和力的差異。結(jié)果顯示抗hFSHR抗體濃度為1×104ng/mL時(shí)，自制品和原研品的作用曲線均平行往右移動，對KGN細(xì)胞作用的EC50增加了3～4倍，從4～5ng/mL提高到了15～25ng/mL。采用JMP軟件對EC50進(jìn)行

9、方差分析，結(jié)果顯示兩組數(shù)據(jù)間無顯著性差異（P＞0.05），自制品和原研品受抗hFSHR抗體影響程度一致，說明二者都是通過hFSHR對KGN細(xì)胞產(chǎn)生作用，這種作用均能夠被抗hFSHR抗體所阻斷，導(dǎo)致rhFSH對hFSHR親和力降低從而對細(xì)胞的刺激作用減弱，且不同來源和批次rhFSH產(chǎn)品對hFSHR的親和力一致。
　　在對rhFSH體外活性的影響因素探討中，本研究從rhFSH蛋白內(nèi)在結(jié)構(gòu)即唾液酸化程度和外部環(huán)境兩方面進(jìn)行考察。由于rh

10、FSH唾液酸化程度的不同會導(dǎo)致在體內(nèi)半衰期有所區(qū)別，因此著重考察了rhFSH唾液酸的含量不同對體外活性的影響。采用不同的唾液酸酶切條件處理rhFSH，通過非還原和還原SDS-PAGE確認(rèn)該酶切條件下蛋白性質(zhì)有無發(fā)生改變，并初步確認(rèn)酶切效果；然后采用等電聚焦電泳（IEF）確認(rèn)唾液酸去除效果，結(jié)果顯示酶切后樣品的pI范圍均升高至pH6.0以上，由于唾液酸帶負(fù)電荷，IEF中顯示低pI范圍，酶切后pI升高說明唾液酸被有效去除；采用高效離子色譜-

11、安培檢測器法（HPAEC-PAD）對唾液酸含量進(jìn)一步精確測定，結(jié)果顯示唾液酸含量從酶切前的10mol/mol rhFSH降為0，說明唾液酸被完全去除。為確認(rèn)唾液酸含量與體外活性是否呈相關(guān)性，在rhFSH純化過程中通過離子交換層析中收集不同鹽濃度洗脫的蛋白組分，通過IEF檢測各組分具有不同的pI范圍，HPAEC-PAD結(jié)果也顯示低pI蛋白的唾液酸含量相對越高，說明pI與唾液酸含量存在相關(guān)性，二者結(jié)果可以相互印證，可以通過pI范圍準(zhǔn)確預(yù)測唾

12、液酸化水平。
　　對上述樣品進(jìn)行體外活性測定，結(jié)果顯示唾液酸被完全去除后體外活性由13.9IU/μg增加到56.1～83.0IU/μg，提高了4～6倍；含有不同含量唾液酸樣品也顯示出不同的體外活性，采用JMP軟件對體外活性和唾液酸含量進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示二者之間存在非常顯著的相關(guān)性（R2=0.999, P＜0.05），體外活性隨唾液酸程度的增加而降低。從分子結(jié)構(gòu)上推測是由于rhFSH蛋白糖鏈末端的唾液酸化分子的多少會直接影

13、響rhFSH與hFSHR結(jié)合的空間位阻，唾液酸含量越高，造成rhFSH與hFSHR結(jié)合的空間位阻增大，與hFSHR親和力降低，從而使體外活性降低。但是與體外FSHR親和力不同，在體內(nèi)由于唾液酸含量增加，導(dǎo)致在體內(nèi)的代謝改變，導(dǎo)致在體內(nèi)的半衰期延長，因此某種程度上說體內(nèi)活性與體外活性存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　綜上所述，rhFSH的體外活性與等電點(diǎn)、唾液酸含量、體內(nèi)代謝等都具有相關(guān)性，可通過體外活性預(yù)測唾液酸化程度、等電點(diǎn)分布以及體內(nèi)代謝

14、情況，因此在工藝開發(fā)、質(zhì)量控制、體內(nèi)藥效評價(jià)都具有重要參考價(jià)值。
　　在外部影響因素探討中，本研究選用經(jīng)CHO表達(dá)純化的以磷酸鹽為緩沖液體系的rhFSH蛋白，考察溫度、光照、反復(fù)凍融等條件對體外活性的影響，并考察純度、亞基解離和氧化情況等，確認(rèn)活性變化的內(nèi)在因素。結(jié)果顯示蛋白在常溫、光照和反復(fù)凍融情況下，體外活性保持穩(wěn)定，也未發(fā)生純度降低、亞基解離、氧化等現(xiàn)象，比較穩(wěn)定；40℃條件下隨著放置時(shí)間的延長，體外活性有一定程度的降低，且

15、出現(xiàn)了不同程度的亞基解離，采用JMP軟件對體外活性和純度做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者之間存在相關(guān)性（R2=0.971，P＜0.05），純度降低時(shí)造成體外活性的下降；在60℃條件下5天時(shí)體外活性就損失了80%左右，在第10天時(shí)體外活性幾乎完全喪失；純度也在第5天時(shí)明顯降低，約60%的亞基發(fā)生解離，隨放置時(shí)間延長亞基解離逐漸增加，在15天時(shí)純度降低至20%，除有大部分亞基解離外還有5～10%的聚體產(chǎn)生；因此推測由于高溫導(dǎo)致蛋白發(fā)生解離和聚合，