鮑魚內(nèi)臟蛋白肽的制備及其體外活性研究.pdf

1、利用鮑魚內(nèi)臟制備具有生物活性的蛋白肽，是實現(xiàn)鮑魚資源綜合利用的有效途徑。本研究以鮑魚內(nèi)臟為原料，通過酶解、超濾制備蛋白肽，初步探討鮑魚蛋白肽分離組分和抗氧化活性之間的關(guān)系。然后，對鮑魚蛋白肽進(jìn)行分離純化，對獲得的抗氧化肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。最后，考察鮑魚蛋白肽對氧化損傷的人皮膚細(xì)胞和人腫瘤細(xì)胞增殖的影響。
　　首先，本文利用超濾膜對鮑魚內(nèi)臟酶解物進(jìn)行分離，考察了各分子量段酶解物的成分組成和抗氧化活性。利用截留分子量為10000 Da、3

2、000 Da、500 Da的超濾膜分離得到FA、FB、FC和FD四個組分中，F(xiàn)A組分的總糖和蛋白含量分別為34.06％和17.20％，而FB、FC和FD等組分主要是由蛋白組成，其游離氨基酸含量分別高達(dá)23.20 g/100 g，25.47 g/100g和28.68 g/100 g。根據(jù)Tricine-SDS-PAGE、液相色譜和β-消除反應(yīng)的分析結(jié)果，表明FA組分含有N-糖苷鍵結(jié)合的糖蛋白和分子量25 kDa的蛋白，F(xiàn)B、FC和FD的分

3、子量主要分布在300 Da左右。體外抗氧化結(jié)果表明，F(xiàn)D組分具有較好的清除自由基活性。
　　其次，在鮑魚內(nèi)臟蛋白肽小試放大試驗中，利用截留分子量為10000 Da、1000 Da、200 Da膜分離得到FA、FB和FC三個組分。FA組分的總糖和蛋白含量分別為21.49％和55.12％，而FB和FC主要由蛋白肽構(gòu)成。氨基酸組成分析結(jié)果顯示，在FC組分中疏水性氨基酸(Leu、Phe和Tyr)含量最高。三個分離組分主要含有鉀、鈉、磷等礦

4、物質(zhì)。根據(jù)蛋白肽抑制亞油酸自動氧化的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)FC組分具有最高的抗氧化能力。FC組分經(jīng)凝膠柱和反向色譜分離后，獲得分子量440.0154 Da酪氨酸肽和分子量522.1545 Da苯丙氨酸肽。
　　最后，考察了AVP對人皮膚細(xì)胞和人腫瘤細(xì)胞的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鮑魚內(nèi)臟蛋白肽對HSF細(xì)胞的增殖效果明顯優(yōu)于HaCat細(xì)胞。在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷模型中，經(jīng)1.00-4.00 mg/mL的AVP預(yù)孵后能明顯提高HSF細(xì)胞存活率、提高細(xì)

5、胞外SOD、GS H-Px以及細(xì)胞內(nèi)SOD活性、降低細(xì)胞MDA含量。經(jīng)0.25-4.00 mg/mL的AVP預(yù)孵后雖然能明顯提高HaCat細(xì)胞存活率，但只有1 mg/mL的AVP能明顯提高HaCat細(xì)胞外GSH-Px活性以及胞內(nèi)GSH-Px和SOD活性，并使胞內(nèi)MDA含量出現(xiàn)一定程度的下降。另一方面，當(dāng)培養(yǎng)液含濃度＞2.00 mg/mL的AVP時，MDA-MB-231細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的生長都得到明顯的抑制，而且MDA-MB-231細(xì)

6、胞的存活率明顯低于HepG2細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果，當(dāng)腫瘤細(xì)胞生長受到抑制時，MDA-MB-231細(xì)胞會收縮變圓，而HepG2細(xì)胞結(jié)團(tuán)數(shù)目減少、細(xì)胞體積變小，兩種細(xì)胞都可以發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞減少、凋亡細(xì)胞增加。不管是MDA-MB-231細(xì)胞還是HepG2細(xì)胞，在瓊脂糖電泳中都沒有發(fā)現(xiàn)DNA降解片段。
　　綜上所述，酶解結(jié)合超濾制備的鮑魚內(nèi)臟蛋白肽具有較好的抗氧化活性，其酪氨酸肽和苯丙氨酸肽是主要的抗氧化成分。低濃度的蛋白肽能促進(jìn)人