CYP3A5基因多態(tài)性表達(dá)體系的構(gòu)建及對藥物代謝和效應(yīng)的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建重組人CYP3A5基因多態(tài)性釀酒酵母表達(dá)體系;評價(jià)CYP3A5基因多態(tài)性對氨氯地平等藥物代謝的差異及效應(yīng)的影響;初步探索microRNA對CYP3A5基因表達(dá)的調(diào)控。
　　方法：⑴通過PCR擴(kuò)增得到CYP3A5各基因多態(tài)性cDNA全片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后，將目的基因片段插入到經(jīng)相同內(nèi)切酶雙酶切過的質(zhì)粒pYES2/CT上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選陽性克隆，提取CYP3A5基因多態(tài)性重組表

2、達(dá)質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體CYP3A5-pYES2/CT轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1，用SG培養(yǎng)基誘導(dǎo)其蛋白表達(dá)，并提取酵母蛋白微粒體，即為CYP3A5藥物代謝酶。⑵體外代謝:將CYP3A5基因多態(tài)性酶代謝氨氯地平、地爾硫卓，非洛地平和中藥三七總皂苷等藥物，采用LC-MS和HPLC儀測定其代謝反應(yīng)量，以曲線擬合方法優(yōu)化分析，并計(jì)算Km、Vmax和Vmax/Km值，繪制米氏動力學(xué)曲線。⑶體內(nèi)代謝:篩選湘雅三醫(yī)院健康管理中心的服用氨氯地平

3、原發(fā)性高血壓患者57例和腎移植科服用地爾硫卓移植后高血壓患者32例;分別治療4周后抽取外周血，離心后提取血漿，一方面，模擬體內(nèi)環(huán)境對血漿中藥物進(jìn)行CYP3A5酶處理，LC-MS和HPLC分別測定各處理組代謝前后的血藥濃度，計(jì)算CYP3A5各基因型酶對氨氯地平和地爾硫卓的代謝速率;另一方面，對患者進(jìn)行CYP3A5基因分型，LC-MS和HPLC測定各基因型患者氨氯地平和地爾硫卓血藥濃度，分別計(jì)算其體內(nèi)代謝速率。⑷篩選湘雅三醫(yī)院健康管理中心的

4、服用氨氯地平原發(fā)性高血壓患者57例，提取患者DNA，對患者進(jìn)行CYP3A5的基因型檢測，分為CYP3A5*1/*，CYP3A5*1/*3，CYP3A5*4和CYP3A5*6四個(gè)不同的基因型組，在氨氯地平治療前后分別測量各基因型組患者血壓，記錄治療前后患者血壓的變化情況，分析CYP3A5基因多態(tài)性對氨氯地平降壓效應(yīng)的影響。⑸使用targetscan、miRanda和Pictar等軟件預(yù)測可能作用CYP3A5基因的miRNA，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和篩

5、選，發(fā)現(xiàn)miR-410在很大程度與CYP3A5 mRNA的3'-UTR結(jié)合;為了驗(yàn)證該結(jié)果，選用HepG2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)共分5組，分別為空白對照組，miR-410 mimic（類似物）組，miR-410 mimic陰性對照物組，miR-410 inhibitor（抑制劑）組，miR-410 inhibitor陰性對照物組;空白對照組加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用real-time和western-blot鑒定CYP3

6、A5 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　結(jié)果：①體外構(gòu)建了人重組細(xì)胞色素CYP3A5釀酒酵母表達(dá)體系，包括CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3、CYP3A5*4和CYP3A5*6等4個(gè)單核苷酸突變株釀酒酵母表達(dá)載體，并成功在釀酒酵母細(xì)胞中進(jìn)行真核表達(dá)。②CYP3A5基因多態(tài)性對氨氯地平的代謝速率大小為:CYP3A5*1/*3＞CYP3A5*6＞CYP3A5 wt＞CYP3A5*4;對地爾硫卓的代謝速率大小為:CYP3A5 w

7、t＞CYP3A5*6＞CYP3A5*1/*3＞CYP3A5*4;對非洛地平的代謝速率大小:CYP3A5 wt＞CYP3A5*4＞ CYP3A5*6＞CYP3A5*3;對三七總皂苷的代謝速率大小:CYP3A5WT＞CYP3A5*4＞CYP3A5*6＞CYP3A5*1/*3.體內(nèi)和體外代謝速率大小一致。③CYP3A5基因分型:對湘雅三醫(yī)院健康管理中心的57名服用氨氯地平的高血壓患者基因型的測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)服用氨氯地平的高血壓患者中CYP3A5

8、*1/*1共7名(12.3％)，CYP3A5*1/*3共28名(49.1％)，CYP3A5*4共2名(3.5％)和CYP3A5*6共2名(3.5％)。④與CYP3A5*1/*基因型相比，CYP3A5*1/*3和CYP3A5*4基因型患者的氨氯地平降壓療效顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，CYP3A5*6基因型患者的降壓療效無明顯差異。⑤與空白對照組相比，miR-410 mimic轉(zhuǎn)染組CYP3A5蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)，而miR

9、-410 inhibitor轉(zhuǎn)染組結(jié)果正好相反(P＜0.001)，其他兩個(gè)陰性對照組CYP3A5蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與空白對照組沒有明顯差異。各轉(zhuǎn)染組的CYP3A5 mRNA的表達(dá)水平無顯著變化。
　　結(jié)論：⑴構(gòu)建了重組人細(xì)胞色素CYP3A5基因多態(tài)性釀酒酵母表達(dá)體系。⑵所構(gòu)建的CYP3A5基因多態(tài)性釀酒酵母表達(dá)體系可以用于臨床評價(jià)氨氯地平等藥物的體內(nèi)、外代謝和療效的差異。⑶miR-410參與CYP3A5蛋白表達(dá)的調(diào)控，是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)