葉酸受體介導(dǎo)pH敏感Decoy-ODN納米粒的研究.pdf

1、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription; STAT3)是一類胞漿轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路JAK2/STAT3途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究證實(shí)阻斷STAT3通路后能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡。“誘騙”寡核苷酸技術(shù)(decoy oligodeoxynucleotide，Decoy-ODN)可競爭性抑制轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子

2、序列相結(jié)合，阻止癌基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，實(shí)現(xiàn)腫瘤基因治療。但由于裸露的外源基因易被體內(nèi)核酸酶降解，轉(zhuǎn)染效率低。因此，為了提高其體內(nèi)傳輸?shù)姆€(wěn)定性及細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，本課題研究了一種具有一定靶向性、長循環(huán)功能、溶酶體逃逸功能及高轉(zhuǎn)染性能的基因傳遞系統(tǒng)。
　　 合成了水溶性三甲基殼聚糖(trimethyl chitosan chloride，TMC)，利用葉酸(Folateacid,FA)和聚乙二醇（po

3、lyethylene glycol，PEG）對TMC進(jìn)行化學(xué)修飾得到葉酸偶聯(lián)聚乙二醇修飾三甲基殼聚糖(FA-PEG-TMC)，通過核磁共振及紅外光譜對聚合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，TMC的季銨化率和FA的偶聯(lián)比（每100毫克FA-PEG-TMC材料中含有的FA的毫克數(shù)）分別為45％和8.626％;MTT試驗(yàn)表明FA-PEG-TMC具有低毒性。
　　 以FA-PEG-TMC作為載體材料，結(jié)合pH敏感材料甲基丙烯酸聚合物(Methacryl

4、ic acid-Methyl methacrylate copolymer,MAA)，利用TMC季銨化所帶正電荷與帶負(fù)電的Decoy-ODN和MAA通過靜電結(jié)合作用制備載基因葉酸受體介導(dǎo)pH敏感的納米粒，納米粒為類球形，包封率在90％以上，平均粒徑約為130nm，Zeta電位12mV;當(dāng)Decoy-ODN與MAA摩爾比10∶1時(shí)，納米粒具有良好的pH敏感性，良好的抗核酸酶活性及血漿穩(wěn)定性。
　　 體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)PT-M

5、AA-ODN納米粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率隨著N/P的增加而增加，當(dāng)N/P≥8.0時(shí)，納米粒在KB細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和Hela細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率均在80％以上，相當(dāng)于或高于商品化轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000與ODN的復(fù)合物;并顯著高于PT-MAA-ODN納米粒的轉(zhuǎn)染效率;葉酸阻斷性實(shí)驗(yàn)表明了FPT-MAA-ODN納米粒具有葉酸受體介導(dǎo)的靶向作用。FPT-MAA-ODN納米粒與FPT-ODN納米粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率相當(dāng)，說明荷負(fù)電的pH敏感性材料MAA的加入對F

6、PT-MAA-ODN納米粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率無顯著影響;與Lipo2000-ODN復(fù)合物相比，F(xiàn)PT-MAA-ODN納米粒具有良好的血清穩(wěn)定性。
　　 利用MTT試驗(yàn)考察了FPT-MAA-ODN納米粒對KB細(xì)胞和HepG2細(xì)胞增殖的抑制能力，結(jié)果表明，相同孵育時(shí)間內(nèi)，F(xiàn)PT-MAA-ODN納米粒對KB細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的增殖抑制率均明顯高于Naked-ODN(p＜0.05)，略高于Lipo2000-ODN復(fù)合物組，其細(xì)胞毒性與Li

7、po2000-ODN復(fù)合物相當(dāng)（載ScrambleODN組）;孵育24h后，F(xiàn)PT-MAA-ODN納米粒對KB細(xì)胞的增殖抑制率顯著高于FPT-ODN納米粒和PT-MAA-ODN納米粒(p＜0.05)，對HepG2細(xì)胞的增殖抑制率明顯高于PT-MAA-ODN納米粒(p＜0.05)，綜上說明，F(xiàn)PT-MAA-ODN納米粒具有低毒、高效、靶向以及pH敏感的特性。
　　 體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)PT-MAA-ODN納米粒誘導(dǎo)腫瘤

8、細(xì)胞凋亡率最大接近20％，優(yōu)于商品化的Lipo2000(15％);與FPT-ODN納米粒和PT-MAA-ODN納米粒相比，F(xiàn)PT-MAA-ODN納米粒誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡效果更明顯，進(jìn)一步驗(yàn)證說明了FPT-MAA-ODN納米粒具有葉酸受體靶向性及pH敏感性;對照載Scramble-ODN組，結(jié)果表明FPT-MAA-ODN納米粒細(xì)胞毒性較低。
　　 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，通過瘤內(nèi)注射和尾靜脈注射給藥，F(xiàn)PT-MAA-ODN納米粒均能很好

9、地抑制腫瘤的生長，說明FPT-MAA-ODN納米粒具有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性和腫瘤靶向性;Lipo2000-ODN復(fù)合物經(jīng)尾靜脈注射給藥后的抑瘤效果明顯低于瘤內(nèi)注射，可能是因?yàn)長ipo2000-ODN復(fù)合物的體內(nèi)穩(wěn)定性以及組織特異性差。與FPT-ODN納米粒和PT-MAA-ODN納米粒相比，具有葉酸受體靶向pH敏感的FPT-MAA-ODN納米粒的抑瘤效果更明顯。
　　 綜上所述，通過靜電結(jié)合作用制備的FPT-MAA-ODN納米粒是一種