Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路抑制人腦膠質(zhì)瘤生長的體內(nèi)研究.pdf

1、人腦膠質(zhì)瘤是中樞系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，其中膠質(zhì)母細胞瘤占顱內(nèi)腫瘤的近50％。雖然近年來手術及術后的放療和化療取得了很大的進步，但不幸的是，其確診后的生存期仍然讓人失望，只有12-15個月。因此，新的治療膠質(zhì)母細胞瘤的方法在改善預后和病人生活質(zhì)量方面極需提高。到目前為止，人們普遍認為腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個多種基因參與、多環(huán)節(jié)、多階段、多步驟的復雜過程。所以僅僅干預一個腫瘤相關基因很難達到治療膠質(zhì)瘤的目的。近年來，一些轉(zhuǎn)錄因子被逐漸發(fā)現(xiàn)，

2、它們在調(diào)節(jié)多個腫瘤相關基因方面起重要作用。換句話說，這些轉(zhuǎn)錄因子可以看作是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的總開關。因此，靶向性阻斷某個轉(zhuǎn)錄因子治療腫瘤越來越受到人們的關注，也逐漸成為治療膠質(zhì)瘤的一個新策略。 信號傳導和轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3，Signal Transducers and Activators of Transcription3）是細胞信號傳導通路JAK2/STAT3途徑的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，存在于胞漿，參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育，細胞的正常

3、生長、分化和惡變等過程。持續(xù)活化的STAT3能夠調(diào)控許多腫瘤發(fā)生的環(huán)節(jié)，包括細胞周期，凋亡，腫瘤血管形成及腫瘤細胞逃逸免疫系統(tǒng)等。因此它被看作癌基因并且實驗證實阻斷STAT3通路后可以使腫瘤細胞的增殖受到抑制，凋亡增加。這些都為STAT3作為分子靶點治療膠質(zhì)瘤提供了強有力的證據(jù)。 到目前為止，已經(jīng)有幾種阻斷STAT3通路的策略，包括顯性負性調(diào)節(jié)，反義核苷酸，RNA干擾技術，生化制劑，雙鏈或單鏈誘騙寡核苷酸技術。誘騙寡核苷酸技術（

4、decoy oligodeoxynucleotide，Decoy-ODN），將體外人工合成，有高度親和性，并且模擬目標轉(zhuǎn)錄因子靶基因上啟動子順式元件的序列合成的小分子“誘騙”DNA，轉(zhuǎn)染導入腫瘤細胞，競爭性地抑制靶基因啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的結合，降低其轉(zhuǎn)錄活性，阻止這些致癌基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而誘導凋亡，抑制腫瘤細胞增殖。由于它的高效，低成本和高特異性等優(yōu)點，誘騙寡核苷酸技術廣泛地應用于包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌和頭頸部鱗癌在內(nèi)的多種腫瘤的研究

5、。結果顯示，阻斷STAT3通路后腫瘤細胞的生長顯著受到抑制并引起凋亡，然而，對膠質(zhì)瘤在體內(nèi)生長情況的影響卻鮮為人知。本課題旨在研究和探討應用Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖的體內(nèi)效應和機制。研究內(nèi)容分為三個部分。 一、人腦膠質(zhì)瘤組織細胞中STAT3異常表達研究 目的: 檢測人腦膠質(zhì)瘤細胞系以及臨床標本中STAT3及其磷酸化活化蛋白的表達情況，研究人腦膠質(zhì)瘤中STAT3的異常表達

6、及持續(xù)活化的意義，為針對STAT3治療膠質(zhì)瘤的實驗研究奠定基礎。 方法: 1、Western印跡方法檢測60例人腦膠質(zhì)瘤標本和5例正常腦組織標本中STAT3及其磷酸化活化蛋白的表達，并對其異常表達及持續(xù)活化的情況進行統(tǒng)計學分析。 2、Western印跡方法檢測人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251中STAT3及其磷酸化活化蛋白的表達。 結論: 1、人腦膠質(zhì)瘤組織和細胞中廣泛存在著STAT3的過高表達及持續(xù)活化，

7、說明STAT3信號傳導通路在膠質(zhì)瘤中具有重要意義，為抑制STAT3治療膠質(zhì)瘤的研究奠定了基礎。 2、U251細胞系中存在STAT3及其磷酸化的異常表達，可以作為本課題的研究對象。 二、Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖并促進其凋亡的體外研究 目的: 研究陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染STAT3 Decoy-ODN的效果和效率。檢測Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路對人腦膠質(zhì)

8、瘤細胞增殖的抑制效應。檢測Decoy-ODN轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤細胞對其凋亡的影響。 方法: 1、應用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導的DNA轉(zhuǎn)染法將STAT3Decoy-ODN轉(zhuǎn)染導入人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251內(nèi)。 2、流式細胞術檢測FITC標記的STAT3 Decoy-ODN在U251中的轉(zhuǎn)染效率。 3、細胞計數(shù)法檢測Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路后對人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖的

9、抑制效應。 4、Annexin V/PI雙染法檢測Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路后U251細胞的凋亡情況。 結論: 1、應用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導的DNA轉(zhuǎn)染技術，能夠?qū)TAT3 Decoy-ODN高效轉(zhuǎn)染入人腦膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)。 2、STAT3 Decoy-ODN在體外能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖。 3、STAT3 Decoy-ODN在體外能夠促進人腦

10、膠質(zhì)瘤細胞凋亡。 三、Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖的體內(nèi)研究 目的: 評價裸鼠皮下種植U251細胞的效果，評價瘤內(nèi)注射Decoy-ODN的效果，檢測在體內(nèi)Decoy-ODN對人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡的影響，并對其相關基因和蛋白的表達水平進行統(tǒng)計學分析，進而深入探討在體內(nèi)Decoy-ODN靶向性阻斷STAT3信號通路抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖的相關機制。 方法:

11、1、皮下注射法將U251細胞注入4周齡裸鼠右脅腹皮下。 2、觀察約一周時間，皮下瘤結節(jié)能明顯觸到后，瘤內(nèi)注射Decoy-ODN并檢測其在體內(nèi)對人腦膠質(zhì)瘤細胞生長的影響。 3、免疫組織化學法檢測體內(nèi)STAT3 Decoy-ODN作用人腦膠質(zhì)瘤細胞后對增殖標志物Ki67表達水平的影響。 4、Tunel法檢測在體內(nèi)Decoy-ODN對人腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響。 5、RT-PCR檢測分析在體內(nèi)STAT3 Deco

12、y-ODN對細胞周期控制基因和凋亡相關基因mRNA表達水平的影響。 6、免疫組織化學法檢測體內(nèi)STAT3 Decoy-ODN對細胞周期控制基因和凋亡相關基因蛋白表達水平的影響。 結論: 1、U251細胞能夠在裸鼠體內(nèi)成瘤。 2、STAT3 Decoy-ODN在體內(nèi)能夠顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞生長。 3、STAT3 Decoy-ODN在體內(nèi)能夠顯著抑制人腦膠質(zhì)瘤細胞增殖。 4、STAT3 De

13、coy-ODN在體內(nèi)能夠顯著誘導人腦膠質(zhì)瘤細胞凋亡。 5、STAT3 Decoy-ODN在體內(nèi)能夠下調(diào)細胞周期和抗凋亡相關基因的表達。 6、STAT3 Decoy-ODN在體內(nèi)能夠降低細胞周期和抗凋亡相關蛋白的表達。 總之，通過本研究表明，在體內(nèi)應用STAT3 Decoy-ODN能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤的生長，增殖并誘導細胞凋亡。下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞中細胞周期和抗凋亡相關基因的表達，同時降低細胞周期和抗凋亡相關蛋白的表達。為