mTOR信號通路和GOLPH3在人腦膠質瘤中的表達和臨床意義.pdf

1、背景和目的：膠質細胞瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，約占成人顱內腫瘤的50％-60％。在治療上，以手術治療為主，因腫瘤浸潤性生長，多數(shù)腫瘤與正常腦組織無明確的界限，不能徹底切除，因而術后多需要進行放射治療、化學治療等多種輔助療法。由于腫瘤的惡性生物學特性，即使進行了綜合治療，腦膠質瘤術后復發(fā)幾乎也是不可避免的。其中多形性膠質母細胞瘤(glioblastomamultiforme，GMB)惡性程度最高，具有很強的增殖和侵襲能力，復發(fā)率很

2、高，患者的預后極差，經(jīng)過手術治療、放療及化療等綜合治療的患者，平均生存期仍不到1年，2年生存率為10％，僅有不到5％的病人可長期生存。因此，深入研究膠質瘤的發(fā)病機制，可以進一步提高對膠質瘤的認識及總體的治療水平研究。
　　 細胞的增殖與凋亡維持著組織的動態(tài)平衡，一旦細胞發(fā)生異常增殖或凋亡抑制，則可導致正常的組織細胞向惡性腫瘤細胞轉化?？梢酝ㄟ^遏制腫瘤細胞的異常增殖或者促進腫瘤細胞的凋亡來有效的遏制腫瘤細胞的新生及發(fā)展?；A醫(yī)學在

3、腫瘤發(fā)生機制的研究中，增殖和凋亡一直是研究的熱點。和其他惡性腫瘤一樣，膠質瘤中也存在細胞的異常增殖及凋亡的抑制，涉及多種基因的異常表達或抑制。
　　 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是一種重要的信號轉導分子，參與多種病理和生理過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號轉導通路的異常激活與乳腺癌、肺癌、膠質瘤等多種實體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關

4、，已成為腫瘤治療的重要靶點，本研究的第一部分通過免疫組化檢測87例膠質瘤病例中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號轉導通路的三個關鍵蛋白，pAKT、pmTOR和p-p70S6K以及survivin和Ki-67的表達探討它們在膠質瘤中表達的臨床病理意義及相互關系。
　　 GOLPH3又稱GPP34、GMx33、MIDAS，由5p13基因編碼，分子量約30KD，最初是在對小鼠高爾基體進行蛋白質組學分析時發(fā)現(xiàn)的，它屬于高爾基體基質蛋白，從酵母到

5、人類高度保守。GOLPH3(GMx33)與高爾基體反面的基質動態(tài)相連，快速從TGN移動到細胞質，并分布于細胞內分泌泡和細胞質膜Scott KL等通過對多種實體腫瘤進行基因組分析發(fā)現(xiàn)，GOLPH3在乳腺癌、卵巢癌、非小細胞性肺癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中存在過量表達。體外實驗發(fā)現(xiàn)GOLPH3過表達時腫瘤細胞的體積變大、細胞周期縮短、有絲分裂加快并且在瓊脂糖凝膠上形成的瘤塊體積明顯增大，而應用小干擾RNA或基因敲除技術降低GOLPH3的表達

6、時，腫瘤細胞體積縮小、有絲分裂分減慢同時在瓊脂糖凝膠上形成的瘤塊體積變小，體內實驗結果與此相同。這提示GOLPH3可能是一個致癌蛋白，具有影響腫瘤細胞的分化、增殖的作用。本研究的第二部分通過檢測87例膠質瘤病例中高爾基磷酸化蛋白-3(GOLPH3)的表達，探討GOLPH3是否是膠質瘤可能的分子發(fā)病機制。
　　 材料和方法：本研究的第一部分收集了山東大學齊魯醫(yī)院和聊城市腦科醫(yī)院87例膠質瘤的蠟塊標本和臨床資料，采用半定量免疫組化染

7、色(Envision法)檢測pAKT、pmTOR和p-p70S6K以及survivin和Ki-67的表達強度，分析它們與常見臨床病理參數(shù)化之間的關系：本研究的第二部分應用反轉錄PCR和Western-blot研究76例液氮凍存膠質瘤組織中GOLPH3的表達情況，分析它與膠質瘤惡性程度的相關性。
　　 結果：87例膠質瘤病例中Ⅰ～Ⅱ級27例，Ⅲ級24例，Ⅳ級36例。pAKT、pmTOR和p-p70S6K以及Ki-67和surviv

8、in定位于細胞漿或細胞核，在腫瘤組織中呈彌漫或片狀分布，以細胞膜、胞質或胞核內出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達。pAKT在各級膠質瘤中的陽性率分別為Ⅰ～Ⅱ級70.4％(19/27)，Ⅲ級70.8％(17/24)，Ⅳ級75％(27/36)；pmTOR在各級膠質瘤中的陽性率分別為Ⅰ～Ⅱ級77.8％(21/27)，Ⅲ級75％(18/24)，Ⅳ級72.2％(26/36)；p-p70S6K在各級膠質瘤中的陽性率分別為Ⅰ～Ⅱ級63％4(17

9、/27)，Ⅲ級70.83％(17/24)，Ⅳ級80.6％(29/36)。pAKT、pmTOR和p-p70S6K在各級別膠質瘤中的陽性表達率無顯著差異(P>0.05)。有42例同時表達pmTOR、pAKT和p-p70S6K，另外45例膠質瘤組織中三者僅有一種或兩種表達，顯示在不同的個體中mTOR信號通路激活水平不盡相同。pAKT、pmTOR和p-p70S6K的表達水平在Ⅲ級和Ⅳ級病例中明顯高于Ⅰ～Ⅱ級，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，

10、說明pAKT、pmTOR和p-p70S6K的表達水平隨著膠質瘤病理級別的增高而升高。統(tǒng)計學分析顯示三者的表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤大小和術前KPS評分無關(P>0.05)；survivin的陽性率為Ⅰ～Ⅱ級70.4％(19/27)，Ⅲ級75％(18/24)，Ⅳ級91.7％(33/36)。survivin在低級別的膠質瘤中染色以淡黃色為主，染色細胞所占百分比較少，隨著腫瘤病理分級的增高，染色逐漸加深，陽性細胞所占百分比亦增多，sur

11、vivin的表達強度在Ⅲ級和Ⅳ級病例中明顯高于Ⅰ～Ⅱ級，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明它的表達強度隨著膠質瘤病理級別的增高而升高。
　　 76例液氮凍存膠質瘤組織采用RT-PCR與Western-blot方法檢測GOLPH3的表達。RT-PCR檢測了包括9例正常腦組織和76例不同級別膠質瘤中GOLPH3基因水平，結果發(fā)現(xiàn)，GOLPH3基因在正常腦組織中不表達，76例膠質瘤中40例可見表達，差異明顯(x2=8.9474，

12、P=0.0028)不同級別膠質瘤中的表達率為膠質母細胞瘤63.64％(7/11)、星形細胞瘤Ⅲ級52％(13/25)、Ⅱ級51.85％(14/27)和Ⅰ級46.15％(6/13)，各組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；GOLPH3基因的表達值在Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級和膠質母細胞瘤分別為(14.17±2.32)％、28.14±2.98)％、(60.15±4.39)％、(88.57±5.26)％，差異顯著(P<0.01)。Western-b

13、lot的檢測結果與RT-PCR一致，顯示不同級別膠質瘤組織中GOLPH3的陽性表達率無顯著性差異，而其表達值隨病理級別增高有明顯升高的趨勢，高級別的膠質瘤中GOLPH3蛋白表達顯著上調，其上調程度與腫瘤的惡性程度呈正相關(P<0.01)。
　　 結論：
　　 1.mTOR信號通路各關鍵蛋白的表達強度與膠質瘤的惡性程度有關，在高級別的膠質瘤中表達強度高于低級別的膠質瘤，可能在膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。臨床上可根據(jù)