cRGD-siEGFR分子腫瘤靶向性及其抗惡性膠質(zhì)瘤的體內(nèi)外作用研究.pdf

1、目的：
　　1.篩選驗證有效沉默EGFRmRNA表達的siRNA序列及其骨架修飾方式。
　　2.合成cRGD-siEGFR分子并且對其結(jié)構(gòu)和純度進行鑒定分析。
　　3.體外研究cRGD-siEGFR分子的血漿穩(wěn)定性。
　　4.體外研究cRGD-siEGFR分子的細胞靶向性，細胞毒性及其特異性沉默EGFRmRNA表達的功能。
　　5.荷瘤裸鼠模型研究cRGD-siRNA分子的腫瘤靶向性及其在體內(nèi)的代謝分布。<

2、br>　　6.荷瘤裸鼠模型研究cRGD-siRNA分子抗腫瘤生長的生物學(xué)活性及其相關(guān)機制（基因沉默效率和腫瘤細胞凋亡情況）;
　　7.荷瘤裸鼠模型研究cRGD-siRNA分子對免疫原性和肝腎功能的影響。
　　方法：
　　1.EGFR siRNA序列驗證和骨架修飾
　　通過RT-qPCR法進行對EGFR siRNA序列沉默EGFRmRNA的效率進行驗證，并對驗證后的序列進行骨架修飾，主要通過對EGFR siRNA正

3、義鏈或反義鏈的5'或3'端進行甲氧基修飾以及關(guān)鍵位置的U替換為T，以提高siRNA的穩(wěn)定性，降低免疫原性和脫靶效應(yīng)。
　　2.cRGD-siEGFR分子的合成
　　將cRGD肽的氨基與8-氨基-3，6-二氧雜辛酸(PEG)的羧基脫水縮合，得到cRGD-PEG，再與3-Maleimidopropionic Acid(MPA)的羧基脫水縮合，得到cRGD-PEG-MPA，最后通過巰基與EGFR siRNA分子正義鏈的5'端共軛連

4、接，得到人工合成的cRGD-siEGFR。LC-MS對合成的cRGD-siEGFR進行結(jié)構(gòu)鑒定，高效液相色譜(HPLC)檢測cRGD-siRNA分子的合成純度。
　　3.cRGD-siEGFR分子的血漿穩(wěn)定性
　　未經(jīng)修飾siRNA、不同骨架修飾EGFR siRNA、以及合成的雙鏈cRGD-siEGFR分子，與小鼠新鮮血漿1∶1混合，在37℃條件孵育不同時間后，采用1.2％瓊脂糖凝膠電泳測定其穩(wěn)定性。
　　4.cRGD

5、-siEGFR分子體外生物學(xué)功能研究
　　CCK-8法評價cRGD-siRNA分子的體外細胞毒性。共聚焦顯微鏡檢測Cy5標記siRNA分子在細胞中的分布，以此驗證cRGD-siEGFR分子的細胞靶向性。RT-qPCR和western blot評價cRGD-siEGFR分子在細胞水平抑制EGFR mRNA和EGFR蛋白表達的作用。流式細胞術(shù)定量檢測U87 MG細胞對cRGD-siEGFR-cy5的攝取能力。CCK-8和EDU實驗考察

6、cRGD-siEGFR抑制U87MG細胞的增殖作用。流式細胞術(shù)測定cRGD-siEGFR誘導(dǎo)U87 MG細胞凋亡的作用。
　　結(jié)果：
　　1.EGFR siRNA序列驗證和骨架修飾
　　經(jīng)篩選驗證，發(fā)現(xiàn)sense strand:5'-CAA AGU GUG UAA CGG AAUA dTdT-3'; antisense strand:5'-UAU UCC GUU ACA CAC UUUG dTdT-3'的EGFRsiR

7、NA序列具有較好的沉默效應(yīng)，沉默EGFR mRNA的效率可達80％以上。確定了siRNA序列的骨架修飾方法，即在正義鏈和反義鏈的兩端的三個堿基進行甲氧基修飾，可顯著提高EGFR siRNA的穩(wěn)定性，且不降低其沉默效率。
　　2.cRGD-siEGFR分子的合成
　　LC-MS鑒定結(jié)果表明，合成的cRGD-siEGFR分子質(zhì)量與理論分子質(zhì)量一致，證明合成成功。反相HPLC的純度分析結(jié)果表明cRGD-siEGFR分子的純度可達8

8、8.0％。
　　3.cRGD-siEGFR分子的血漿穩(wěn)定性
　　實驗結(jié)果表明，裸EGFR siRNA在血漿中穩(wěn)定性較差，12h后大量降解，24h全部降解;第三種骨架修飾方式（即在正義鏈和反義鏈的兩端的三個堿基進行甲氧基修飾）siRNA的穩(wěn)定性最好，36h后仍有少量siRNA未被降解;cRGD-siRNA分子結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，到48小時僅有部分降解。
　　4.cRGD-siEGFR分子體外生物學(xué)功能研究
　　(1)CCK

9、-8實驗結(jié)果表明cRGD-siRNA分子細胞毒性非常小。當cRGD-siRNA給藥濃度達到1500nM時，共培養(yǎng)24h后，細胞活性仍達到90.56％，濃度增大到2000nM時，細胞活性仍可達到82.92％。
　　(2)共聚焦顯微鏡觀察cRGD-siEGFR對U87 MG細胞的特異性靶向作用。cRGD-siEGFR可較好的將EGFR siRNA遞送進入細胞內(nèi)。而裸siRNA無法進入細胞內(nèi)部，經(jīng)RAD特異性封閉αvβ3受體后，cRGD

10、-siEGFR也無法進入細胞內(nèi)，表明cRGD-siEGFR可特異性的靶向高表達αvβ3受體的腫瘤細胞，如U87 MG細胞系。
　　(3)RT-qPCR實驗結(jié)果表明，與control組的EGFR mRNA表達水平相比，轉(zhuǎn)染濃度100 nM和200nM時cRGD-siEGFR沉默效率較低，分別為2.55％和15.10％，與Control組相比不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.809和P=0.073）。與Control組相比，500nM、800

11、nM、1000nM和lipo2000/siRNA組的EGFR mRNA表達水平均顯著下調(diào)，表達量分別為:47.39％、21.93％、13.34％和18.57％，且均有顯著差異(P＜0.01)。從轉(zhuǎn)染的劑量可以看出，隨著濃度梯度的增大，cRGD-siEGFR分子的沉默效率逐漸增大，但達到1000nM時，其沉默效率超過了陽性對照lipo2000/siRNA組，且存在統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.034)。
　　(4)Western Blot實驗

12、結(jié)果表明，與control組的EGFR蛋白表達水平相比，裸siRNA組和cRGD-siNC組不存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。cRGD-siEGFR和lipo2000/siRNA的EGFR蛋白表達水平顯著低于control組，分別為26.47％和15.04％(P＜0.01)。表明cRGD-siEGFR可有效沉默U87 MG細胞內(nèi)EGFR蛋白表達。
　　(5)流式細胞術(shù)實驗結(jié)果表明，裸siRNA幾乎不能進入U87 MG細胞內(nèi)，Cy5

13、陽性率僅為1.27％，熒光強度11.67，這與共聚焦顯微鏡的結(jié)果一致。與裸siRNA-Cy5組相比較，U87 MG對cRGD-siEGFR-cy5(100nM)、cRGD-siEGFR-cy5(400nM)和lipo2000/siRNA-cy5的攝取能力較好，攝取陽性率分別為97.97％，98.68％和98.58％，平均熒光強度分別為347.00，1145.00和3133.67。且隨著給藥劑量增加，攝取量也相應(yīng)增加，400nM的cRGD

14、-siEGFR-cy5其攝取量是100nM劑量組的4倍，但相對于lipo2000/siRNA-cy5組，U87 MG對cRGD-siEGFR-cy5攝取量相對較低，只有l(wèi)ipo2000/siRNA-cy5組攝取量的35％。
　　(6)CCK-8實驗結(jié)果表明，不同濃度cRGD-siEGFR分子(400nM、600nM、800 nM)在48h和72h均具有抑制U87 MG細胞增殖的作用，48h各濃度組細胞增殖活性依次為(77.11±1

15、0.19)％、(61.13±12.20)％、(44.52±7.35)％，72h各濃度組細胞增殖活性依次為(68.60±9.23)％、(52.11±8.21)％、(33.74±6.84)％，與Control組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。
　　EDU實驗結(jié)果與CCK-8實驗結(jié)果一致。
　　(7)流式細胞術(shù)實驗結(jié)果表明不同濃度的cRGD-siEGFR(400nM、600nM、800 nM)均可不同程度的誘導(dǎo)U87 MG細

16、胞產(chǎn)生凋亡，凋亡率分別為(26.59±5.87)％，(45.23±6.99)％和(53.88±7.38)％，與Control和陰性組相比，均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　通過將cRGD肽與小分子量PEG接頭直接共價偶聯(lián)到EGFR siRNA正義鏈末端，成功合成了cRGD-siEGFR分子，體外和體內(nèi)的研究結(jié)果表明cRGD-siEGFR分子可特異性的靶向腫瘤部位，并進入腫瘤間質(zhì)，特異性沉默EGFR mRNA