腎上腺惡性腫瘤新型分子靶向治療的作用及其機制研究.pdf

1、第一部分熱休克蛋白90抑制劑對惡性嗜鉻細胞瘤的抑制作用
　　目的:研究HSP90在良惡性嗜鉻細胞瘤中表達情況，觀察其抑制劑17-AAG和Ganetespib對大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞系的細胞增殖、凋亡及VEGF、HSP90、STAT3蛋白表達的影響;建立裸鼠嗜鉻細胞瘤移植瘤模型，研究HSP90抑制劑17-AAG和Ganetespib對其作用;探討HSP90抑制劑17-AAG和Ganetespib對嗜鉻細胞瘤治療的作用及分子機制。

2、
　　方法:免疫組織化學、Western Blot檢測HSP90在良、惡性嗜鉻細胞瘤中的表達情況。不同濃度梯度的17-AAG和Ganetespib處理PC12細胞12h、24 h和48 h后采用MTT方法檢測HSP90抑制劑17-AAG和Ganetespib對PC12細胞增殖能力的影響。應(yīng)用流式細胞儀檢測不同濃度的HSP90抑制劑17-AAG和Ganetespib處理后對PC12細胞凋亡的影響，及不同濃度Ganetespib處理后

3、對PC12細胞周期的影響。Western blot檢測不同濃度的HSP90抑制劑Ganetespib處理對PC12細胞VEGF、HSP90、STAT3蛋白表達水平的影響。建立裸鼠嗜鉻細胞瘤移植瘤模型，通過測量裸鼠移植瘤體積和重量，病理學方法檢測腫瘤形態(tài)，免疫組織化學、Westernblot檢測腫瘤組織中HSP90、STAT3和ERBB2的表達，研究17-AAG、Ganetespib對腫瘤的影響。
　　結(jié)果:HSP90在惡性嗜鉻細胞

4、瘤中的蛋白表達水平高于良性嗜鉻細胞瘤，而正常腎上腺髓質(zhì)組織中HSP90表達水平最低，三組之間差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。17-AAG、Ganetespib對PC12細胞均有明顯的抑制增殖作用，并呈現(xiàn)劑量與時間的依賴性，其中17-AAG的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.05μmol/L。17-AAG可以有效促進PC12細胞的凋亡，且具有時效關(guān)系;Ganetespib可以促進PC12細胞凋亡，使其細胞周期阻滯，且具有劑量相關(guān)性。Gane

5、tespib作用于PC12細胞24h后，可使HSP90、VEGF及STAT3蛋白表達明顯減少。成功建立裸鼠嗜鉻細胞瘤移植瘤模型，實驗結(jié)束時17-AAG組、Ganetespib組與對照組比較，用藥組瘤體較小，差異明顯;處死裸鼠，取出腫瘤并稱重，17-AAG組瘤體重3.29±0.57g，明顯低于對照組7.94±1.20g，抑瘤率為58.6％。
　　結(jié)論:HSP90表達水平與惡性嗜鉻細胞瘤的生物學行為有關(guān)，HSP90抑制劑17-AAG、

6、Ganetespib能夠抑制移植瘤中HSP90、VEGF及STAT3的表達，進而抑制腫瘤的生長，通過靶向抑制HSP90可能有助于對晚期惡性嗜鉻細胞瘤的治療，從而提高患者生存時間，但這需要大樣本的臨床試驗來證明。本研究可為HSP90抑制劑在后期的臨床應(yīng)用研究中提供一定的參考，為惡性嗜鉻細胞瘤的分子靶向治療提供新的方法和思路。
　　第二部分mTOR抑制劑對惡性嗜鉻細胞瘤的作用機制
　　目的:通過應(yīng)用哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mam

7、malian target of rapamycin，mTOR)抑制劑依維莫司于大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞系裸鼠移植瘤，并觀察其對移植瘤生長及裸鼠生存的影響，進一步探討依維莫司對嗜鉻細胞瘤腫瘤生長及抑制血管生成的作用及其機制，為嗜鉻細胞瘤分子靶向治療提供指導。
　　方法:將大鼠嗜鉻細胞瘤PC12接種于裸鼠腋窩皮下，2周后待移植瘤體積增加至合適大小，并將荷瘤裸鼠隨機分為對照組和治療組，對照組給予生理鹽水灌胃10mg/kg，實驗組給予

8、依維莫司灌胃5mg/kg，處理四周后分別測量腫瘤的體積及生存時間;取腫瘤標本后分別通過免疫組化及Western blot實驗檢測腫瘤組織中信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達水平。
　　結(jié)果:對照組裸鼠的平均生存時間為（25.3±2.4）天，實驗組則為（37.8±4.6）天，并用Kaplan-Meier，Log-Rank方法分析并檢測兩組生存差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);對照組裸鼠移植瘤

9、平均體積為（4340.67±794.07）mm3，實驗組體積則為（1506.01±352.69）mm3，兩組移植瘤體積亦具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論: mTOR抑制劑依維莫司可以明顯抑制裸鼠腫瘤體積增加，并改善生存預(yù)后，而同時可以降低腫瘤組織中STAT3和VEGF的表達水平;提示未來依維莫司可以作為嗜鉻細胞瘤的分子靶向治療藥物。
　　第三部分STAT3與IGF2在腎上腺皮質(zhì)癌的表達與意義
　　目的:探討胰

10、島素樣生長因子-2(IGF-2)和信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子-3(signaltransducers and activators of transcription，STAT3)在腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)中的表達及其臨床意義，并用CD34標記血管內(nèi)皮細胞，定量檢測微血管密度(microvesseldensity，MVD)的表達，結(jié)合臨床資料，探討它們在腎上腺皮質(zhì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及血管形成中的意義。
　　方法:選取上海瑞金醫(yī)院1986年到2

11、010年間手術(shù)切除且有完整臨床和病理資料的腎上腺皮質(zhì)腫瘤標本44例，將標本分為良性腎上腺皮質(zhì)腺瘤（良性組）20例，ACC（惡性組）24例。免疫組化標記采用間接法，EnVisionTM+檢測系統(tǒng)。IGF-2和STAT3采用半定量計數(shù)法進行評分，以細胞染色強度和染色細胞所占比例兩種指標的積分之和作為判斷陽性或陰性的依據(jù)，若兩種積分之和大于3分則表達為陽性，小于或等于3分則為陰性。腫瘤內(nèi)MVD計數(shù):在低倍物鏡下選取高血管密度區(qū)，之后在高倍鏡(

12、×400)下計數(shù)3個視野內(nèi)被CD34染成棕黃色的血管數(shù)，取其平均值作為該例腫瘤的MVD值。比較并分析良、惡性腎上腺皮質(zhì)腫瘤組織之間IGF-2和STAT3的高、低表達率及MVD的區(qū)別。
　　結(jié)果:免疫組化檢測結(jié)果顯示，STAT3在ACC組中的表達為79.17％(19/24)，良性組中為20.00％(4/20)，兩者之間有極顯著性差異（P＜0.001）;IGF-2在ACC組中呈高表達(17/24，70.83％)，在良性組中表達較低(5

13、/20，25.00％)，IGF-2在ACC組中的表達與在良性組中的表達有顯著性差異（P=0.002）。MVD在ACC組中的表達為(84.70±12.44)，良性組中為(21.05±8.07)，兩者之間有顯著性差異(P＜0.001)。Spearman等級相關(guān)性分析顯示，STAT3的表達與MVD呈正相關(guān)(rs=0.832，P＜0.001)，IGF-2的表達與MVD也呈正相關(guān)(rs=0.703，P=0.001)。
　　結(jié)論:IGF-2和