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文檔簡介
1、目的:肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化是肝纖維化過程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TGF-β信號(hào)通路在肝纖維化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。HES1的蛋白表達(dá)與活化的肝星狀細(xì)胞呈正相關(guān)關(guān)系,它所屬的一類轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合序列class C(CACGNG)結(jié)合。通過轉(zhuǎn)錄因子圈套策略(Decoy ODN)篩選出能抑制TGF-β信號(hào)通路的class C Decoy ODNs,來抑制HSC的活化。另外,將有效的class C Decoy ODNs與Smad3 Dec
2、oy ODN聯(lián)合作用活化的肝星狀細(xì)胞,觀察對(duì)TGF-β信號(hào)通路的抑制作用能否更好。
方法:
(1)通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測分析TGF-β信號(hào)通路中TGF-β及其下游靶基因(如COLΙα1、TIMP1、α-SMA等)的啟動(dòng)子區(qū)與class C序列匹配程度;
(2)通過熒光素酶報(bào)告基因分析法檢測class C Decoy ODNs對(duì)TGF-β信號(hào)通路中TGF-β及其下游靶基因啟動(dòng)子活性的影響;
(3)通
3、過Western blot方法進(jìn)一步驗(yàn)證class C Decoy ODNs對(duì)TGF-β信號(hào)通路中TGF-β及其下游靶基因在蛋白水平的影響;
(4)通過熒光素酶報(bào)告基因分析法檢測能影響TGF-β及其下游靶基因啟動(dòng)子活性的Decoy ODNs組合。
結(jié)果:
(1)通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TGF-β及其靶基因COLΙα1、TIMP1、α-SMA以及HES1的啟動(dòng)子上有class C序列的存在,而COLΙα2的基因
4、啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)沒有class C序列存在;
(2)通過熒光素酶報(bào)告基因分析法檢測出能下調(diào)TGF-β信號(hào)通路中TGF-β及其下游靶基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子水平的class C Decoy ODNs,其中包括class C1 Decoy ODN、class C2 Decoy ODN、class C3 Decoy ODN以及class C4 Decoy ODN;
(3) Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)4種class C De
5、coy ODNs中,對(duì)TGF-β及其靶基因影響范圍較廣的是class C1 Decoy ODN,下調(diào)效果相對(duì)較好的是class C2 Decoy ODN,而class C3 Decoy ODN與class C4 Decoy ODN對(duì)其影響效果差;
(4)通過熒光素酶報(bào)告基因分析法篩選出一定程度上能影響TGF-β及其下游靶基因啟動(dòng)子活性的Decoy ODN組合,包括class C1 Decoy ODN與Smad3 Decoy O
6、DN的組合,以及class C2 Decoy ODN與Smad3 Decoy ODN的組合,而且第一種組合比第二種組合對(duì)TGF-β及其下游靶基因啟動(dòng)子活性下調(diào)作用好。
結(jié)論:Class C1/2 Decoy ODN能通過抑制TGF-β信號(hào)來抑制大鼠肝星狀細(xì)胞的活化。Class C1 Decoy ODN聯(lián)合Smad3 Decoy ODN,能夠下調(diào)活化的大鼠肝星狀細(xì)胞中,TGF-β應(yīng)答元件TRE活性,以及TGF-β靶基因TIMP1
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