聚乳酸納米粒介導(dǎo)decoy策略調(diào)控腦血管內(nèi)皮細(xì)胞組織因子活性的研究.pdf

1、腦血栓形成發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，一直缺乏切實(shí)有效的防治方法。本研究運(yùn)用近年來興起的納米技術(shù)，將干預(yù)基因片段定向?qū)肽X血管內(nèi)皮細(xì)胞，運(yùn)用抑制組織因子的基因療法探索防治腦血栓形成的新途徑；研究中運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)腦血栓疾病中血管內(nèi)皮細(xì)胞表面組織因子表達(dá)及活性變化，明確其在腦血栓形成中的作用；進(jìn)而應(yīng)用Decoy策略從轉(zhuǎn)錄水平研究組織因子活性的調(diào)控因素及機(jī)理；以聚乳酸為材料，通過表面修飾等方法，研制具有腦血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向性的納米粒，以納

2、米粒為載體，將Decoy寡核苷酸片段定向?qū)肽X血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過干預(yù)組織因子活性實(shí)現(xiàn)對(duì)腦血栓形成的早期預(yù)防和治療，為腦血管疾病的基因治療從實(shí)驗(yàn)室邁向臨床提供有力的基礎(chǔ)。 第一部分腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞組織因子的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制研究 目的：研究大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)中核因子κB(NF-κB)在組織因子(TF)表達(dá)調(diào)控中的作用； 方法：分離、培養(yǎng)大鼠BMECs，分別經(jīng)LPS、TNF-α刺激0、1h、2h、4h、8

3、h、16h不同時(shí)間后，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMECs胞膜表面TF表達(dá)量的變化，RT-PCR檢測(cè)TFmRNA表達(dá)水平的變化，WesternBlot檢測(cè)刺激因子對(duì)細(xì)胞核內(nèi)活化的NF-κB組份P65含量的影響；并觀察NF-κB的特異性抑制劑PDTC對(duì)BMECs中TFmRNA表達(dá)水平的影響作用； 結(jié)果：TF在BMECs細(xì)胞中的表達(dá)同刺激因子作用呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系，10μg/mlLPS或100ng/mlTNF-α刺激1～2h時(shí)TFmRNA水平

4、達(dá)到峰值，核內(nèi)P65含量相應(yīng)顯著增高；經(jīng)100μmol/LPDTC預(yù)處理的BMECs在刺激因子誘導(dǎo)下，TF表達(dá)水平不升高； 結(jié)論：BMECs在受到炎癥因子、細(xì)菌內(nèi)毒素刺激時(shí)TF表達(dá)增高，NF-κB活化在LPS或TNF-α誘導(dǎo)的BMECsTF表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中有重要作用。 第二部分腦血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向性納米粒載體的研制 目的：制備聚乳酸(polylacticacid，PLA)納米粒，研究該納米載體在小鼠各臟器組織中的

5、分布特征，探討其對(duì)鼠腦組織的靶向性； 方法：納米沉積法制備空白及經(jīng)聚山梨醇-80(T-80)表面修飾的PLA納粒，原子力顯微鏡觀測(cè)微觀形貌、粒徑，zeta電位/粒度分析儀分別測(cè)定粒度分布范圍和zeta電位值；MTT比色法評(píng)價(jià)納米粒的細(xì)胞毒性；熒光分光光度計(jì)檢測(cè)并比較不同表面特性的PLA納米粒在小鼠各臟器組織的分布，巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)T-80表面修飾對(duì)于PLA納米粒逃避單核—巨噬系統(tǒng)吞噬的作用；透射電鏡觀察腦組織中納米粒的分布區(qū)

6、域，分析電鏡對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中葉綠素銅標(biāo)記的納米粒進(jìn)行鑒定； 結(jié)果：所制PLA納粒為規(guī)整、均勻的球形顆粒，其等效粒徑為162.1nm，多分散系數(shù)為0.108；T-80修飾的聚乳酸納米粒能特異性地分布于小鼠腦組織，透射電鏡及分析電鏡證實(shí)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中有納米粒的聚集； 結(jié)論：T-80表面修飾的PLA納米粒能較特異性地被鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞攝取，該載體可能成為選擇性作用于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的優(yōu)良給藥載體。 第三部分載NF

7、-κBdecoy聚乳酸納米粒對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)調(diào)控的體外研究 目的：探討由PLA納米粒包裹的NF-κBdecoy寡核苷酸片段對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠腦BMECs組織因子表達(dá)活性的調(diào)控功能； 方法：制備包裹熒光標(biāo)記NF-κBdecoy的納米粒混懸液，檢測(cè)其物理表征、包封率和體外釋放情況。共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)觀察和檢測(cè)培養(yǎng)的BMECs攝取載decoy-納米粒的效率和細(xì)胞內(nèi)分布，運(yùn)用RT-PCR及Westernblot技術(shù)

8、比較攝取納米粒的細(xì)胞在LPS刺激下TFmRNA和胞核內(nèi)P65表達(dá)豐度的變化； 結(jié)果：制備的decoy-納米粒平均粒徑為302nm，多分散系數(shù)為0.036，體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)28天其總釋放率達(dá)92.3％，流式細(xì)胞儀檢測(cè)到BMECs對(duì)decoy-納米粒平均攝取率達(dá)到(90.4±5.26)％，被攝取的decoy-納米粒位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，RT-PCR結(jié)果提示經(jīng)納米粒包載的NF-κBdecoy具有生物活性，可以顯著抑制LPS作用下腦微血管內(nèi)

9、皮細(xì)胞的TF表達(dá)水平，蛋白印跡結(jié)果顯示核提取物中P65的豐度顯著降低； 結(jié)論：聚乳酸納米粒能將NF-κBdecoy寡核苷酸片段遞送至細(xì)胞內(nèi)，且能保持生物活性，該方法為腦血栓病基因治療的可能性提供了依據(jù)。 第四部分載NF-κBdecoy聚乳酸納米粒在腦微血栓形成動(dòng)物模型中作用的研究目的：探討由PLA納米粒包裹的NF-κBdecoy寡核苷酸片段對(duì)大鼠腦皮質(zhì)微血栓形成模型局部TF表達(dá)的調(diào)控作用； 方法：光化學(xué)誘導(dǎo)法建

10、立大鼠腦皮質(zhì)微血栓形成模型，靜脈注射decoy-納米粒后，應(yīng)用原位雜交的方法研究模型動(dòng)物微血管內(nèi)皮細(xì)胞中TF表達(dá)，ELISA技術(shù)研究模型動(dòng)物血漿TF含量的變化； 結(jié)果：熒光顯微鏡觀察到decoy-納米粒能進(jìn)入模型動(dòng)物的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，NF-κBdecoyODNs經(jīng)PLA納米粒導(dǎo)入模型動(dòng)物后，照射部位內(nèi)皮細(xì)胞TFmRNA表達(dá)顯著下降，而注射對(duì)照M-decoy納米粒和空白對(duì)照組的模型動(dòng)物TFmRNA仍呈高表達(dá)，血漿TF含量變化與T