納米粒子介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子基因治療兔心肌缺血的療效.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景:應(yīng)用血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)基因轉(zhuǎn)染治療缺血性心臟病，在國內(nèi)外已研究多年，并取得初步有效的臨床試驗(yàn)結(jié)果。在相關(guān)的大多數(shù)臨床試驗(yàn)中采用的基因載體是裸質(zhì)?；虿《据d體，裸質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染效率低，易被體內(nèi)核酸酶降解，外源基因表達(dá)時(shí)效短；病毒載體如腺病毒轉(zhuǎn)染效率高，但存在著免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)。因此繼續(xù)尋求安全、有效的基因傳遞系統(tǒng)是其研究領(lǐng)域的一個(gè)重要方面。 近年來，

2、納米級聚合物粒子開始用于基因的傳遞，實(shí)驗(yàn)已證實(shí)納米粒子包裹寡聚核苷酸后，可增加寡核苷酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的量；同時(shí)增加寡核苷酸對抗核酸酶的能力，防止寡核苷酸的降解，增強(qiáng)其在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。同時(shí)納米粒子因其良好的組織穿透能力，極易被細(xì)胞吸收以及所具有的控釋效應(yīng)，使之在血管疾病的治療中有著潛在的不可比擬的優(yōu)越性。 目的: 1.制備VEGF基因納米粒子并觀察其一般性狀。 2.VEGF基因納米粒子體外轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。3.

3、心肌細(xì)胞吞噬VEGF基因納米粒子的形態(tài)學(xué)研究。 4.VEGF基因納米粒子對心肌缺血的療效觀察。 方法1.制備VEGF基因納米粒子向聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)二氯甲烷溶液中加入濃度為10mg/ml的pcDNA3.1/VEGF165質(zhì)粒1ml，高速攪拌至油包水乳液；再加入1.0％聚乙烯醇(PVA)水溶液繼續(xù)攪拌成水/油/水復(fù)乳液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸去二氯甲烷；4℃，10000r/min離心10min，加蒸餾水離心清洗3次

4、；取上清液進(jìn)行DNA包封率的計(jì)算，收集沉淀冷凍干燥，備用。測定其載藥量、體外釋放情況及粒徑。 2.VEGF基因納米粒子轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，傳代后按2×105個(gè)細(xì)胞/孔，接種于24孔板中，培養(yǎng)48h，使達(dá)到80％融合。于6個(gè)孔中加入VEGF165基因納米粒子；6個(gè)孔中加入VEGF165裸質(zhì)粒；6個(gè)孔為空白對照組，培養(yǎng)48h。應(yīng)用RT-PCR法檢測VEGFmRNA水平，應(yīng)用ELISA法檢測VEGF蛋白表達(dá)水平，觀察納米基因

5、載體為真核細(xì)胞傳遞基因的可行性。 3.心肌細(xì)胞吞噬VEGF基因納米粒子的形態(tài)學(xué)研究制備納米粒子懸浮液，采用成年新西蘭兔4只，3％戊巴比妥納(1ml/kg)經(jīng)耳緣靜脈麻醉，逐層暴露心臟。用微量注射器直視下向心肌內(nèi)注射VEGF165基因納米粒子懸浮液0.8ml。96h后心肌注射部位取材，固定切片，透射電鏡下觀察。評價(jià)其向心肌組織內(nèi)傳遞基因的可行性。 4.VEGF基因納米粒子對心肌缺血的療效觀察。建造兔急性心肌缺血模型，隨機(jī)分

6、為三組，納米粒子組(n=12)心肌內(nèi)注射VEGF165納米粒子，裸質(zhì)粒組(n=12)注射VEGF165裸質(zhì)粒，對照組(n=8)注射生理鹽水。術(shù)后1月對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行心臟超聲檢查，觀察心功能改善情況，取注射部位的心肌組織，Ⅷ因子相關(guān)抗原染色，觀察心肌組織中毛細(xì)血管生成情況。 結(jié)果: 1.成功制備VEGF165基因納米粒子(1)包封率為：88.4％。(2)載藥率為：1.87％。(3)體外測定DNA釋放情況為：最初24h有24.

7、9％/24h±4.3％/24h(n=4)的DNA被釋放出來，隨后的4d內(nèi)以7.2％/24h±2.3％/24h的速率釋放，然后維持1.6％/24h±0.5％/24h的速率釋放，持續(xù)觀察14d后DNA釋放終止。(4)電鏡觀察納米粒子的粒徑在50-300nm之間。 2.VEGF165基因納米粒子可體外轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞RT-PCR結(jié)果顯示納米粒子組可見特異性條帶，裸質(zhì)粒組、對照組無此特異性條帶，這說明納米粒子可將VEGF基因?qū)胄募〖?xì)胞。E

8、LISA法檢測結(jié)果顯示，納米粒子組的細(xì)胞上清中VEGF蛋白質(zhì)量濃度為385ng/l±46ng/l，而裸質(zhì)粒組與空白對照組則未檢測到VEGF蛋白。 3.心肌細(xì)胞內(nèi)可見被吞噬的納米粒子心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)及胞核內(nèi)可見大量被吞噬的納米粒子，部分位于線粒體間或吸附于線粒體膜上。部分納米粒子位置靠近核膜或附于核膜上，并且有些已被核膜包裹。 4.VEGF基因納米粒子治療心肌缺血的療效術(shù)后1月納米粒子組較其它兩組在室壁運(yùn)動及左室射血分?jǐn)?shù)改善

9、明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納米粒子組、裸質(zhì)粒組及對照組心肌內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)分別為(57±12)、(41±14)及(24±8)，各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。 結(jié)論:成功構(gòu)建了VEGF165基因納米粒子，納米粒子可用于VEGF165基因的攜帶、轉(zhuǎn)染和表達(dá)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)心肌細(xì)胞完全可以通過吞噬方式大量攝取VEGF165納米粒子，VEGF165納米粒子做為向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的基因的載體是可行的，與裸質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染相比，VEGF