血管內(nèi)皮生長因子-C在宮頸癌中的表達(dá)及其靶向基因治療.pdf

1、第一部分宮頸癌中VEGF-C mRNA的表達(dá)及其臨床意義 目的：研究血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）mRNA在宮頸癌、原位癌及正常宮頸組織中的表達(dá)情況，分析其在宮頸癌生長與轉(zhuǎn)移中的可能作用。 方法;應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測并分析48例宮頸癌組織、48例原位癌組織及36例正常宮頸組織標(biāo)本中VEGF-CmRNA的表達(dá)情況，分析其與腫瘤的組織病理類

2、型、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、臨床分期之間的關(guān)系。 結(jié)果:VEGF-CmRNA在宮頸癌組織、宮頸原位癌組織及正常宮頸組織中的表達(dá)量有顯著性差異（F=19.21，P<0.05），VEGF-C mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著高于宮頸原位癌組織中的表達(dá)（q=9.13，P<0.05）； VEGF-C mRNA在宮頸原位癌組織中的表達(dá)量明顯高于正常宮頸組織中的表達(dá)（q=4.25，P<0.05）。宮頸癌組織中VEGF-C mRN

3、A的表達(dá)與腫瘤的組織病理類型相關(guān)（F=12.01，P<0.05；q腺癌/鱗癌=3.97，P<0.05；q腺癌/腺鱗癌=6.35，P<0.05；q鱗癌/腺鱗癌=3.50，P<0.05）；宮頸癌組織中VEGF-C mRNA的表達(dá)與病理分化程度相關(guān)（F=9.76，P<0.05；qG1/G2=4.01，P<0.05； qG1/G3=5.33，P<0.05； qG2/G3=4.24，P<0.05）；宮頸癌組織中VEGF-C mRNA的表達(dá)與淋巴結(jié)

4、轉(zhuǎn)移（t=44.15，P<0.05）相關(guān)；宮頸癌組織中VEGF-C mRNA的表達(dá)與腫瘤直徑（t=39.84，P<0.05）相關(guān)；但宮頸癌組織中VEGF-C mRNA的表達(dá)與與宮頸癌的臨床分期無明顯的相關(guān)性（F=2.12，P>0.05）。 結(jié)論:（1）宮頸癌組織中VEGF-C mRNA表達(dá)水平明顯高于宮頸原位癌組織及正常宮頸組織，且與臨床病理之間有良好的相關(guān)性，提示其在宮頸癌生長、轉(zhuǎn)移和預(yù)后過程中起著十分重要的作用。（2）VEG

5、F-C可能成為治療宮頸惡性腫瘤的一個潛在的分子靶點。 第二部分應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞、SiHa細(xì)胞VEGF-C mRNA的表達(dá) 目的:探討血管內(nèi)皮生長因子C在宮頸癌細(xì)胞生長、增殖中的可能作用。 方法:采用基于TaqMan探針技術(shù)的實時熒光定量PCR法檢測體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞、SiHa細(xì)胞中VEGF-C mRNA的表達(dá)。 結(jié)果:人宮頸癌Hela細(xì)胞株中VEGF-

6、CmRNA的表達(dá)明顯高于人宮頸癌SiHa細(xì)胞株中的表達(dá)，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.1，P<0.05）。 結(jié)論:VEGF-C在不同增殖能力的宮頸癌細(xì)胞株中含量不同，該基因可能與宮頸癌細(xì)胞侵襲能力有關(guān)，抑制宮頸癌中VEGF-C的表達(dá)有望可以抑制宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。 第三部分針對VEGF-C的siRSA對人宮頸癌Hela細(xì)胞及Siha細(xì)胞系中VEGF-C的表達(dá)及對細(xì)胞增殖的影響 目的:研究針對VEGF-C的小分子干擾RN

7、A（siRNA）介導(dǎo)的RNA干擾（RNAi）技術(shù)對人宮頸癌Hela細(xì)胞及SiHa細(xì)胞中VEGF-C基因及蛋白的靶向抑制作用，同時觀察對細(xì)胞生長、增殖的影響及形態(tài)的變化，探討針對VEGF-C的siRNA介導(dǎo)RNA干擾技術(shù)在宮頸癌基因治療中的應(yīng)用前景。 方法:根據(jù)siRNA序列設(shè)計原則，設(shè)計并合成三條VEGF-C序列特異性小分子干擾RNA（siRNA）及一條陰性對照siRNA，應(yīng)用德國QIAGEN公司RNAiFectTM Trans

8、fection試劑盒轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞及SiHa細(xì)胞。篩選出最有效的siRNA干擾序列后，分別于轉(zhuǎn)染后12h、24h、48h、72h，應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測Hela細(xì)胞及SiHa細(xì)胞中VEGF-C mRNA的表達(dá)，Western Blot方法檢測VEGF-C蛋白的表達(dá)，MTT及細(xì)胞計數(shù)法檢測siRNA轉(zhuǎn)染對培養(yǎng)細(xì)胞生長增殖的影響。 結(jié)果: 1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞及Siha細(xì)胞轉(zhuǎn)染針對VEGF-C的

9、siRNA6h后于高倍鏡下均可見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，輪廓不規(guī)則，空泡化形成，部分細(xì)胞脫落，有細(xì)胞碎片形成，細(xì)胞數(shù)目較對照組明顯減少，通過熒光標(biāo)記siRNA轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率可達(dá)85％以上，攝入的siRNA主要位于細(xì)胞漿，圍繞胞膜排列；空白對照組及陰性對照組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞透明，細(xì)胞貼壁狀況良好，呈棱形或多角形，數(shù)量較轉(zhuǎn)染實驗組明顯增多。陰性對照組加入轉(zhuǎn)染反應(yīng)液后細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生改變，但換液后，細(xì)胞形態(tài)很快恢復(fù)正常。 2.熒光定量P

10、CR檢測RNAi后Hela細(xì)胞中VEGF-C mRNA表達(dá)統(tǒng)計學(xué)分析表明，干擾12-72h時間內(nèi)，實驗組與陰性對照組VEGFmRNA的表達(dá)量相比明顯降低，差異有顯著性意義（q值依次為6.44、8.75、7.34、19.23，P<0.05）；而陰性對照組及空白組VEGF-C mRNA的表達(dá)的差異在不同時相均無顯著性（P>0.05），干擾效果變化明顯。 3.熒光定量PCR檢測RNAi后Siha細(xì)胞中VEGF-C mRNA表達(dá)轉(zhuǎn)染12

11、、24、48及72h后，實驗組VEGF-CmRNA的表達(dá)水平均明顯下降，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q值分別為16.26、21.44、34.67、15.32，P<0.05）；與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q值分別為15.35、20.62、30.24、17.04，P<0.05）；而陰性及空白對照組VEGF-CmRNA的相對表達(dá)量在不同時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q值分別為2.02、1.98、1.43、1.08，P>0.05）。

12、 4.Western Blot檢測RNAi后Hela細(xì)胞中VEGF-C蛋白的表達(dá) DAB顯色后發(fā)現(xiàn)在46.9KD處有一明顯條帶，與VEGF-C蛋白大小一致。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對western blot結(jié)果進(jìn)行半定量分析，空白對照為1，不同干擾時間的數(shù)值結(jié)果與其進(jìn)行灰度比較。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)與對照組相比，RNAi干擾后目的siRNA對VEGF-C蛋白表達(dá)均有不同程度的影響，且干擾時間越長，效果越明顯，干擾后同一時相各組VEGF-C蛋白

13、的表達(dá)有顯著性差異（P<0.05），干擾后同一時相陰性對照組與空白組之間的差別無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為1.01、0.83、0.71、0.42，P均>0.05）。 5.Western Blot檢測RNAi后Siha細(xì)胞中VEGF-C蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示干擾后12-72h內(nèi)，實驗組VEGF蛋白含量明顯低于各對照組，差異具有顯著性的意義（P<0.05），而陰性對照組和空白組相比則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為0.09，0.49，0.80，1

14、.02，P>0.05）。 6.MTT法檢測針對VEGF-C的RNAi后Hela細(xì)胞的增殖情況MTT法檢測表明針對VEGF-C的siRNA對Hela細(xì)胞生長有明顯的抑制作用，轉(zhuǎn)染后同一時段與空白對照組及陰性對照組細(xì)胞有顯著性差異（F值分別10.58、16.17、23.39、41.94，P均<0.05），轉(zhuǎn)染后陰性對照siRNA12h-72h后對Hela細(xì)胞生長增殖無明顯抑制作用，與同一時段空白對照組之間比較差異無顯著性（t值分別為

15、0.12、0.24、0.06、0.09；P均>0.05）。 7.MTT法檢測siRNA對SiHa細(xì)胞增殖的影響目的siRNA對細(xì)胞生長有明顯的抑制作用，不同時段與各對照組細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F值分別為12.94、32.55、29.45、23.30，P<0.05）；陰性對照siRNA對細(xì)胞生長無明顯抑制作用，且不同時段與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q值分別為0.75、1.09、0.90、0.60，P>0.05）。

16、 8.細(xì)胞計數(shù)法檢測針對VEGF-C的RNAi后Hela細(xì)胞的數(shù)量細(xì)胞計數(shù)法檢測表明目的siRNA對細(xì)胞數(shù)量有明顯影響，不同時間段細(xì)胞數(shù)與空白對照組相比明顯減少（F值分別為4.01、5.32、7.89、13.47，P<0.05），陰性對照siRNA組對細(xì)胞數(shù)量無明顯影響，不同時段細(xì)胞數(shù)與空白對照組之間相比差異無顯著性（t值分別為0.71、0.49、0.14、0.93，P>0.05）。 9.細(xì)胞計數(shù)法檢測針對VEGF-C的RNAi

17、后Siha細(xì)胞的數(shù)量細(xì)胞計數(shù)法檢測表明轉(zhuǎn)染后12h-72h各組Siha細(xì)胞數(shù)均不相同（F值分別為4.23、6.68、7.12、12.1，P均<0.05），實驗組細(xì)胞數(shù)明顯低于其余各組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義；空白組、陰性對照組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.48、0.24、0.38、1.23，P均>0.05）。 結(jié)論:（1）針對VEGF-C的siRNA可以有效抑制宮頸癌細(xì)胞VEGF-CmRNA及其蛋白表達(dá)量，抑制細(xì)胞生長，表明VEGF-