低糖應(yīng)激條件下TIGAR依存的自噬調(diào)控失衡參與介導腦血管內(nèi)皮細胞損傷機制研究.pdf

1、血腦屏障(BBB)是位于血液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)之間的一個動態(tài)而復雜的屏障結(jié)構(gòu)。血腦屏障表達有其特有的跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，以調(diào)節(jié)各種物質(zhì)進出腦實質(zhì)。血腦屏障由一層緊密連接沒有開口的腦微血管內(nèi)皮細胞構(gòu)成，并含有低水平的吞飲小泡以及由緊密連接和粘附連接組成的連接復合體。作為保護腦實質(zhì)的重要屏障，維護BBB的結(jié)構(gòu)及功能正常極其重要。
　　葡萄糖是腦部最重要的養(yǎng)分，腦組織不能生產(chǎn)也無法儲存葡萄糖，必須依賴血液中的葡萄糖不斷地供應(yīng)，人體每天產(chǎn)

2、生的葡萄糖至少有一半是提供腦部使用。低血糖癥指的是由血糖含量過低引發(fā)的臨床醫(yī)療癥狀。來自于臨床的資料顯示，即使是血糖持續(xù)低下單一因素，也足以引起大腦功能障礙。當血糖太低時，腦部缺乏葡萄糖，將使大腦代謝受到嚴重影響，輕則反應(yīng)遲鈍，重則昏迷甚至神經(jīng)細胞死亡。實際上，血糖過低會破壞腦血管內(nèi)皮細胞屏障功能，導致罹患腦血管疾病風險增加。目前尚無徹底消除由低血糖引發(fā)的內(nèi)皮細胞連接破壞和神經(jīng)血管損傷的調(diào)控手段，因此十分有必要探究并闡釋由低血糖介導的血

3、腦屏障損傷機制。
　　自噬是一個機體內(nèi)自發(fā)的降解機制，包括細胞質(zhì)成分的溶酶體降解等過程，為細胞的重要生命活動提供能量和關(guān)鍵成分。在人類的血管內(nèi)皮細胞中，自噬在正常生理狀態(tài)下主要發(fā)揮清除代謝產(chǎn)物，改善細胞存活環(huán)境的功能。但是在內(nèi)皮細胞受到持續(xù)應(yīng)激源影響時，包括腦缺血、葡萄糖剝奪、缺氧和活性氮成分等，則自噬可能被過度誘發(fā)而出現(xiàn)對細胞的消極影響。大量證據(jù)證明自噬和細胞凋亡也許在時間先后上存在一定的關(guān)聯(lián)，自噬的反?？赡軐е录毎δ苁д{(diào)，甚

4、至促進血管內(nèi)皮細胞死亡。LC3(microtubule-associated protein1light chain3)是細胞內(nèi)重要的自噬標志物，細胞質(zhì)內(nèi)LC3-Ⅰ可能脂化反應(yīng)為LC3-Ⅱ的形式，而LC3-Ⅱ被認為是內(nèi)皮細胞啟動自噬反應(yīng)的指示器。盡管有證據(jù)證明自噬在神經(jīng)退行性疾病過程中出現(xiàn)上調(diào)，但是對低血糖應(yīng)激下大腦內(nèi)皮細胞內(nèi)的自噬作用的增強或抑制的變化規(guī)律還不清楚，對其相關(guān)作用的理解還是知之甚少。
　　過氧亞硝基陰離子(ONOO

5、-)屬于活性氮物種之一，由機體內(nèi)一氧化氮(NO）和超氧陰離子(O2-)反應(yīng)產(chǎn)生。ONOO-通過使蛋白質(zhì)發(fā)生酪氨酸硝化和過氧化物酶泛素化以抑制前列環(huán)素合酶活性。前期也發(fā)現(xiàn)硝化應(yīng)激在缺血性腦損傷過程中可以調(diào)控自噬過程。大量證據(jù)顯示腦血管內(nèi)皮細胞是硝化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病及其并發(fā)癥過程中的主要作用靶細胞。盡管了解到在神經(jīng)血管的損傷和血腦屏障破壞的病理過程中，由硝化應(yīng)激引發(fā)的促進自噬過程和蛋白質(zhì)破壞是重要環(huán)節(jié)，但是其作用機制尚不清楚。
　

6、　TIGAR(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator)存在磷酸激酶2活性，通過促進磷酸戊糖途徑來水解細胞水平的果糖-2，6-二磷酸(fructose-2，6-bisphosphate)和果糖-1，6-二磷酸(fructose-1，6-bisphosphate)，達到抑制糖酵解作用的目的。同時，TIGAR可以激活線粒體呼吸鏈反應(yīng)，調(diào)節(jié)細胞在缺氧條件下的氧化還原代謝作用，促進細胞生存。

7、近期研究表明TIGAR對腦缺血損傷顯示出一定的保護作用，主要是通過增加細胞NADPH水平和促進抗氧化活性以限制氧化應(yīng)激介導的細胞凋亡和線粒體自噬過程。然而，TIGAR在低血糖應(yīng)激下調(diào)節(jié)腦內(nèi)皮細胞緊密連接的破壞過程發(fā)揮保護作用和其潛在的機制仍然不清楚。目前的研究工作目標是闡明由代謝應(yīng)激介導的腦血管內(nèi)皮細胞緊密連接損傷的分子機制，研究重點之一則是解析TIGAR在自噬和大腦內(nèi)皮細胞損傷過程之間所扮演的角色。
　　在本實驗中，深入研究了T

8、IGAR在腦血管內(nèi)皮細胞中低血糖應(yīng)激發(fā)生時的作用。發(fā)現(xiàn)，在低血糖狀況下，TIGAR扮演的是敏感生物傳感器的角色。利用蛋白免疫印跡分析，對無糖培養(yǎng)基另加葡萄糖的條件下24小時培養(yǎng)的腦血管內(nèi)皮細胞進行分析，可觀察到TIGAR表達量伴隨葡萄糖濃度增高而增高。此外，在低糖條件下細胞內(nèi)TIGAR表達量隨著時間延長而增強，但在24小時后較正常對照組相比出現(xiàn)下降。
　　在培養(yǎng)的腦血管內(nèi)皮細胞中，緊密連接蛋白質(zhì)如Claudin-5和occludi

9、n的表達量是反映腦屏障通透性的關(guān)鍵因素。通過在免疫細胞化學實驗使用抗TIGAR抗體觀察到了TIGAR的亞細胞定位。在內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染編碼Claudin-5的GFP慢病毒載體(GFP-Claudin-5)后，在大腦內(nèi)皮細胞緊密連接處觀察到了強GFP熒光。免疫組化圖像分析顯示了在內(nèi)皮細胞中TIGAR和Claudin-5存在共定位。同時，在低血糖應(yīng)激下，觀察到occludin和JAM-A蛋白出現(xiàn)時間和濃度依賴性的分解片段增加，伴有JNK磷酸化作用

10、增強及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)的上調(diào)。在對照條件下，顯示TIGAR在大腦內(nèi)皮緊密連接的亞細胞定位，然而在低血糖損傷24小時后，TIGAR表達量大量減少且緊密連接也失去了完整性。此后，又詮釋了TIGAR在低糖條件誘導的大腦內(nèi)皮細胞損傷中的潛在作用。人類腦血管內(nèi)皮細胞在24小時低血糖條件刺激后再分別轉(zhuǎn)染空載體，重組人類TAT-TIGAR和慢病毒-GFP-TIGAR，結(jié)果顯示TIGAR過表達可以抑制occludin和JAM-A的降解。

11、r>　　進一步，采用形態(tài)學技術(shù)評估了TIGAR對由低血糖引發(fā)的緊密連接損傷的保護作用。免疫細胞化學分析顯示了occludin在大腦血管內(nèi)皮細胞中的亞細胞定位。在低血糖刺激下，occludin在細胞質(zhì)膜呈現(xiàn)彌散性分布。TIGAR的過表達抑制occludin降解并保護內(nèi)皮細胞緊密連接處的完整性。之后用電子顯微鏡顯示了內(nèi)皮細胞緊密連接處的超微結(jié)構(gòu)。在正常對照情況下，內(nèi)皮細胞緊密連接通常出現(xiàn)在細胞與細胞相接觸的區(qū)域，然而這種緊密連接結(jié)構(gòu)會隨著低

12、血糖應(yīng)激增強而被破壞。然而，在細胞培養(yǎng)中LV-TIGAR的過表達則可抑制細胞間緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)的異常破壞。這些結(jié)果表明了TIGAR可以減輕低糖應(yīng)激條件下緊密連接的損害。
　　為了研究緊密連接外膜上在自噬過程中與TIGAR結(jié)合的分子物質(zhì)，使用了質(zhì)譜檢測方法，其中檢測出29種蛋白質(zhì)具有高置信度，可能與自噬中結(jié)合TIGAR相關(guān)。進一步，采用免疫共沉淀技術(shù)確認了鈣調(diào)素和TIGAR的相互作用關(guān)系。為了檢測鈣調(diào)蛋白結(jié)合至TIGAR上的實時動態(tài)

13、變化，確認活細胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子是否具有直接相互作用，進一步利用了熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)。主要以分析檢測CFP標志的鈣調(diào)蛋白(CaM-CFP)和YFP標志的TIGAR蛋白(TIGAR-YFP)變化規(guī)律。觀察在CFP熒光（受體）降低時，YFP熒光（供體）出現(xiàn)急劇上升。
　　基于硝化應(yīng)激的發(fā)生依存于鈣/鈣調(diào)素的活性水平，推測低糖應(yīng)激條件下硝化應(yīng)激介導的TIGAR功能障礙可能與酪氨酸殘基硝基化相關(guān)。低血糖應(yīng)激引發(fā)的mRFP-G

14、FP-LC3斑點形成可以被鈣調(diào)素抑制劑W7(1μM)和ONOO-清除劑Melatonin(100nM)而減弱。進一步，根據(jù)質(zhì)譜分析確認TIGAR蛋白的Y92位點很有可能是發(fā)生硝基化的酪氨酸殘基位點。實驗通過慢病毒介導TIGAR的過表達可以增加NADPH含量水平，保護occludin蛋白，而Y92A位點突變后的TIGAR不再能有效保護內(nèi)皮緊密連接。在低血糖應(yīng)激條件下TIGAR對自噬過程的調(diào)節(jié)作用進一步被證明是抑制了自噬體的形成，因為相對于

15、在24小時低血糖應(yīng)激下的內(nèi)皮細胞模型內(nèi)的熒光斑點，轉(zhuǎn)染入突變的TIGAR反而更能增強mRFP-GFP-LC3熒光斑點?？偟膩碚f，我們的實驗結(jié)果證明了TIGAR在對抗低血糖應(yīng)激誘導的損傷時通過保護內(nèi)皮緊密連接的完整性和調(diào)節(jié)自噬過程來保護血腦屏障。而在這其中，由于其與鈣調(diào)素結(jié)合的特點，使得TIGAR自身極易于成為ONOO-的損傷靶分子。因為ONOO-形成非常依賴于鈣/鈣調(diào)素，而快速形成的ONOO-局部高濃度微環(huán)境極易對周邊蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基

16、造成損傷。
　　最后，在胰島素誘導低血糖的小鼠動物模型上同樣驗證了TIGAR的保護作用。TIGAR過表達來對抗低血糖應(yīng)激作用的效果可以用正電子發(fā)射斷層掃描(positron emission tomography,PET)分析觀察。在低血糖條件下野生型小鼠對FDG的攝取增強，而TIGAR轉(zhuǎn)基因小鼠在低血糖條件下對FDG的標準攝取值則極為微量，這一現(xiàn)象表明了TIGAR過表達在低血糖應(yīng)激條件下可以通過磷酸戊糖途徑代償性改善腦內(nèi)葡萄糖水

17、平，以保護內(nèi)皮緊密連接。更進一步，在低血糖誘導損傷的對照組動物相比，TIGAR轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出的血管保護作用主要是通過抑制Claudin-5降解作用而達到維護微血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)完整性而達到的。通過的電子顯微鏡檢測也在小鼠腦皮層得到相似的結(jié)果，胰島素誘導的低血糖應(yīng)激的小鼠模型體內(nèi)的腦微血管損傷可以被TIGAR基因過表達所逆轉(zhuǎn)。
　　本研究明確了低血糖應(yīng)激條件下腦血管內(nèi)皮細胞內(nèi)硝化應(yīng)激，調(diào)控自噬的TIGAR信號之間的相互關(guān)聯(lián)作用。我們

18、的實驗結(jié)果解釋了低血糖應(yīng)激觸發(fā)的TIGAR表達下調(diào)可以誘發(fā)內(nèi)皮緊密連接的損傷作用，而TIGAR過表達則可以通過限制過度自噬保護內(nèi)皮緊密連接的完整性。而低血糖應(yīng)激條件可以觸發(fā)硝化應(yīng)激，通過TIGAR酪氨酸殘基硝基化而導致TIGAR失活，最終導致腦血管內(nèi)皮細胞保護作用喪失。我們的實驗結(jié)果闡釋了TIGAR通過調(diào)控磷酸戊糖途徑，增加NADPH產(chǎn)量，抑制過度自噬通路，最終表現(xiàn)對腦血管的保護作用。抑制硝化應(yīng)激或提高TIGAR水平為腦血管疾病的預(yù)防和