NAMPT對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及缺血性損傷的作用.pdf

1、研究背景:
　　 尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nicotinamide Phosphoribosyltransferase，NAMPT)，是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)補(bǔ)救合成途徑中的限速酶，這是哺乳動(dòng)物合成NAD的主要途徑。NAMPT在全身多種細(xì)胞表達(dá)，而在腦內(nèi)主要表達(dá)于神經(jīng)元以及血管內(nèi)皮細(xì)胞，NAMPT也可以分泌到細(xì)胞外包括血清中起作用。細(xì)胞內(nèi)NAMPT主要起調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NAD水平的作用，而細(xì)胞外NAMPT被認(rèn)為是一種細(xì)胞因子

2、，參與許多的反應(yīng)包括介導(dǎo)炎癥、氧化應(yīng)激等。
　　 缺血性腦卒中是一種年齡相關(guān)的疾病，能引起神經(jīng)功能的損傷，具有高致死和致殘率。在缺血性腦卒中引起的損傷中，除了神經(jīng)細(xì)胞受到損傷外，也有非神經(jīng)細(xì)胞的損傷，包括腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)缺血非常敏感，在急性腦缺血發(fā)生后，就會(huì)出現(xiàn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，引起血管性水腫，隨后出現(xiàn)血管痙攣和加重缺血損傷。內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管再生對(duì)腦缺血后的恢復(fù)也起了非

3、常重要的作用。因此腦血管內(nèi)皮細(xì)胞也是缺血性腦卒中后很重要的治療靶細(xì)胞。
　　 研究表明，缺血性腦卒中患者血清的NAMPT也顯著增加。在大鼠腦缺血模型中，降低NAMPT的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致缺血損傷加重，而增加NAMPT表達(dá)或者給予NAMPT直接產(chǎn)物NMN則對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用。NAMPT能通過酶活性增加細(xì)胞內(nèi)NAD的水平，抑制腦缺血引起的線粒體膜電位的下降從而對(duì)缺血后的神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用。NAMPT的終產(chǎn)物NAD已經(jīng)被認(rèn)為是一種神經(jīng)保護(hù)劑

4、，在腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡和軸突變性中都具有保護(hù)作用。這些研究提示NAMPT可以成為有效預(yù)防和治療缺血性腦卒中的靶點(diǎn)。
　　 研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NAMPT在維持外周血管內(nèi)皮細(xì)胞正常功能和血管重塑中起了非常重要的作用。NAMPT能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管樣形成，因此，NAMPT被認(rèn)為是一種促血管再生因子。NAMPT對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞還具有抗凋亡、抗衰老等保護(hù)作用，此外，也有體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)認(rèn)為NAMPT與內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有關(guān)。
　　

5、 我們的研究也發(fā)現(xiàn)，在老年小鼠腦中細(xì)胞內(nèi)NAMPT明顯降低，血清中的NAMPT顯著增加，而血清中的NAMPT作為重要的細(xì)胞外NAMPT，直接作用于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。另外，已經(jīng)有較多的臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病、肥胖等代謝性疾病患者的血清NAMPT顯著增高，而眾所周知，這些疾病患者好發(fā)缺血性腦卒中，同時(shí)腦卒中發(fā)生后的腦損傷也明顯比非代謝性疾病患者嚴(yán)重。
　　 那么這種細(xì)胞內(nèi)NAMPT降低，細(xì)胞外NAMPT增高的情況是否對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞生理

6、功能有影響？細(xì)胞內(nèi)外的NAMPT變化對(duì)腦缺血后引起的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是否有影響，若有，是具有保護(hù)作用呢還是具有加重?fù)p傷的作用？具體是通過何種分子機(jī)制？這些問題都尚需進(jìn)一步闡明。
　　 研究目的:
　　 本文擬觀察細(xì)胞內(nèi)外NAMPT對(duì)小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能有何影響，闡明細(xì)胞內(nèi)NAMPT對(duì)腦缺血后引起的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用，揭示細(xì)胞內(nèi)NAMPT影響腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制，包括:
　　 第一部分:NAMP

7、T對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞生理功能的影響;
　　 第二部分:細(xì)胞內(nèi)NAMPT對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血后損傷的影響。
　　 研究方法:
　　 本文以小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3細(xì)胞為主要研究對(duì)象，以NAMPT抑制劑FK866抑制細(xì)胞內(nèi)NAMPT的作用，NAMPT直接產(chǎn)物NMN模擬NAMPT增加，重組的人NAMPT和突變后失去酶活性的NAMPT/H247A模擬細(xì)胞外NAMPT增加，以缺氧缺糖模型(oxygen-glucos

8、e deprivation，OGD)為離體腦缺血性損傷模型，以O(shè)GD0.5 h和OGD4 h誘導(dǎo)缺血性損傷。免疫熒光染色法和免疫印跡法檢測(cè)NAMPT在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá);MTT、LDH法檢測(cè)細(xì)胞活性及損傷程度;細(xì)胞劃痕方法檢測(cè)細(xì)胞遷移;細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量以評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖;PI-Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死;大鼠主動(dòng)脈環(huán)血管再生模型評(píng)估血管再生;NAD/NADH試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NAD變化;免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞自吞噬。
　　

9、 研究結(jié)果:
　　 第一部分NAMPT對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞生理功能的影響
　　 在bEnd.3細(xì)胞中，用免疫熒光和免疫印跡的方法檢測(cè)到有NAMPT的表達(dá)。用FK866抑制bEnd.3細(xì)胞內(nèi)NAMPT，發(fā)現(xiàn)FK86610 nM作用24 h即能明顯降低細(xì)胞內(nèi)NAD的水平，NMN1 mM能完全補(bǔ)充FK866引起的NAD的減少，而單獨(dú)NMN對(duì)細(xì)胞內(nèi)NAD沒有影響。MTT和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K86610-100nM能濃度依賴和

10、時(shí)間依賴的抑制細(xì)胞的增殖和遷移，高濃度FK866還可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。而NAMPT直接產(chǎn)物NMN0.1-1 mM能濃度依賴的逆轉(zhuǎn)FK866的作用，單獨(dú)NMN對(duì)細(xì)胞細(xì)胞活性和遷移均沒有明顯的影響。在大鼠主動(dòng)脈環(huán)新生血管形成的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)FK86610 nM雖然沒有影響新生血管的數(shù)量，但是能夠明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，而FK866100 nM則能明顯抑制新生血管的生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)NAMPT通過調(diào)節(jié)NAD合成參與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的重

11、要生理功能，是腦血管內(nèi)皮細(xì)胞生存和維持正常功能所必需的。此外，我們?cè)诩?xì)胞外給予人重組NAMPT和突變后失去酶活性的NAMPT/H247A，發(fā)現(xiàn)在0.1-1.0μg/ml作用不同時(shí)間(24-72 h)可以促進(jìn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，這一結(jié)果說明，細(xì)胞外NAMPT可以促進(jìn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，并且其作用可能與NAMPT的非酶活性相關(guān)。
　　 第二部分細(xì)胞內(nèi)NAMPT對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血后損傷的影響
　　 我們對(duì)bE

12、nd.3細(xì)胞OGD0.5 h，發(fā)現(xiàn)bEnd.3細(xì)胞活性下降20％左右，但是LDH釋放和細(xì)胞數(shù)量沒有明顯改變，細(xì)胞活性在復(fù)灌24-48 h逐漸恢復(fù)正常，提示OGD0.5 h僅造成細(xì)胞輕度的一過性損傷。在24-48 h的復(fù)灌過程中，細(xì)胞內(nèi)NAD水平逐漸下降，F(xiàn)K866預(yù)給藥可以進(jìn)一步減少細(xì)胞內(nèi)NAD的水平，而NMN能在OGD后補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)NAD。在OGD前24 h預(yù)先用FK86610 nM消耗細(xì)胞內(nèi)NAD可以加重OGD0.5h引起的細(xì)胞活性下

13、降，而NAMPT的直接產(chǎn)物NMN可以完全逆轉(zhuǎn)FK866預(yù)給藥引起的細(xì)胞活性下降，但是不能緩解單獨(dú)OGD0.5 h引起的細(xì)胞損傷。OGD后給予FK866或者NMN對(duì)細(xì)胞活性的恢復(fù)均無顯著影響。這一結(jié)果表明，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NAD水平的降低可以加重細(xì)胞對(duì)輕度缺血性損傷的易感性，但NAD不參與輕度OGD損傷后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞恢復(fù)。
　　 OGD4h導(dǎo)致bEnd.3細(xì)胞活性下降50％左右，同時(shí)伴L(zhǎng)DH釋放增加和細(xì)胞數(shù)量的減少，提示有明顯

14、的細(xì)胞損傷，細(xì)胞內(nèi)NAD水平在OGD4h復(fù)灌24-48 h有增加趨勢(shì)。FK866可顯著降低復(fù)灌后細(xì)胞內(nèi)NAD水平，但NMN對(duì)OGD后及復(fù)灌過程細(xì)胞內(nèi)NAD水平均無影響。FK8661-10 nM對(duì)OGD后及復(fù)灌過程的細(xì)胞活性下降、LDH釋放均無影響，但是給予NAMPT直接產(chǎn)物NMN1 mM可以使OGD4h及復(fù)灌24-48 h的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞活性增加、OGD后的LDH釋放減少。這一結(jié)果說明，在重度腦缺血損傷時(shí)，NMN對(duì)缺血后及復(fù)灌過程的腦血

15、管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。
　　 最后對(duì)細(xì)胞內(nèi)NAMPT在缺血損傷時(shí)的作用機(jī)制進(jìn)行了探討，我們發(fā)現(xiàn)FK86610nM作用48 h和OGD4h都能明顯增加腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的自吞噬，而NMN1 mM和自吞噬抑制劑LY294002都能抑制FK866及OGD4h引起的自吞噬的增加，但是FK866不能加重OGD4 h引起的細(xì)胞自吞噬的增加。這一結(jié)果提示，細(xì)胞內(nèi)NAMPT在腦缺血后對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制可能部分與自吞噬相關(guān)。
　　

16、結(jié)論:
　　 1.細(xì)胞內(nèi)NAMPT通過合成NAD參與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要生理功能，是腦血管內(nèi)皮細(xì)胞生存和維持正常功能所必需的;細(xì)胞外NAMPT可以促進(jìn)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，其作用可能與NAMPT的非酶活性相關(guān)。
　　 2.在輕度缺血性損傷時(shí)，抑制細(xì)胞內(nèi)NAMPT活性可以減少細(xì)胞內(nèi)NAD水平，增加腦血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷的易感性;在重度缺血性損傷時(shí)，增加細(xì)胞內(nèi)NAMPT，補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)NAD，可以對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用;