EphB2對(duì)Aβ寡聚體誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷和NMDAR信號(hào)通路的保護(hù)作用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一種與年齡相關(guān)的，以學(xué)習(xí)記憶減退和認(rèn)知功能障礙為主要特征的神經(jīng)退行性疾病。AD的病理學(xué)特征為細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）沉積形成的老年斑，高度磷酸化的tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，以及腦內(nèi)神經(jīng)元和突觸的丟失。目前認(rèn)為Aβ沉積是AD發(fā)病的核心環(huán)節(jié)，AD患者學(xué)習(xí)記憶的損傷程度與細(xì)胞外Aβ沉積密切相關(guān)，但Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)毒性損傷的具體機(jī)制還不清楚，仍需要進(jìn)一步研究。

2、
　　 Eph是受體酪氨酸激酶中最大的家族，主要分布在興奮性突觸，在發(fā)育過(guò)程中參與組織形成，血管的發(fā)生和軸突導(dǎo)向等，在成熟的腦內(nèi)也發(fā)揮重要作用，參與突觸功能和可塑性的調(diào)節(jié)。目前的研究主要集中在EphA4和EphB2，這兩種受體廣泛分布于大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)。最近研究發(fā)現(xiàn)，在AD轉(zhuǎn)基因小鼠Tg2575腦內(nèi)，EphB2的表達(dá)出現(xiàn)年齡和區(qū)域依賴性的降低。在hAPP(Humanamyloidprecursorprotein，hAPP)轉(zhuǎn)基因

3、小鼠發(fā)病早期，海馬內(nèi)也出現(xiàn)了EphB2表達(dá)的降低，在海馬齒狀回過(guò)表達(dá)EphB2質(zhì)粒，能夠逆轉(zhuǎn)N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸受體(N-methyl-D-asparticacidreceptor，NMDAR)依賴的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（longtermpotentiation，LTP）的降低，同時(shí)也恢復(fù)了hAPP轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，推測(cè)EphB2表達(dá)的降低與AD的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，而AD患者和AD動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶能力下降的主要原因是Aβ的沉積，由此推測(cè)E

4、phB2水平的降低可能是Aβ誘導(dǎo)的突觸可塑性下降和神經(jīng)元丟失的原因，目前仍缺乏直接證據(jù)。
　　 Aβ寡聚體沉積所引起的神經(jīng)元功能損傷和神經(jīng)毒性作用與NMDAR活性的失調(diào)有關(guān)，谷氨酸能神經(jīng)元運(yùn)輸和功能失調(diào)是AD病理的主要原因之一，NMDAR在突觸和突觸外位點(diǎn)表達(dá)的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞的存活有著關(guān)鍵性的作用。EphB2通過(guò)調(diào)節(jié)NMDAR的功能而調(diào)節(jié)谷氨酸能的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，很多研究已經(jīng)證實(shí)EphB2在突觸可塑性中的關(guān)鍵作用，EphB的

5、激活能夠誘導(dǎo)Src激酶-依賴性的NR2B三個(gè)酪氨酸殘基的磷酸化，這對(duì)于調(diào)節(jié)NMDAR在突觸的表達(dá)非常重要。敲除EphB1-3三個(gè)基因的小鼠，興奮性突觸的數(shù)量減少，而只敲除EphB2基因的小鼠，NMDAR在突觸的電流降低，海馬的LTP也受到抑制，說(shuō)明EphB2可能對(duì)于NMDAR在突觸的表達(dá)有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 最近研究發(fā)現(xiàn)，NMDAR的激活所誘導(dǎo)的一系列反應(yīng)決定于NMDAR的亞細(xì)胞定位。激活突觸NMDAR，促進(jìn)cAMP反應(yīng)元件

6、結(jié)合蛋白(cAMPresponseelementbindingprotein，CREB)的磷酸化和細(xì)胞的存活，而激活突觸外NMDAR，抑制CREB信號(hào)途徑并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在海馬神經(jīng)元，CREB是細(xì)胞核Ca2+信號(hào)的重要靶標(biāo)，在神經(jīng)元存活、突觸可塑性以及學(xué)習(xí)記憶中都具有重要的作用。CREB受到多種信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)，其中包括細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號(hào)途徑，而p38MAP

7、K參與了Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用以及NMDAR依賴性的LTP抑制。
　　 因此，我們推測(cè)在海馬神經(jīng)元內(nèi)，Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用可能是由于突觸和突觸外NMDAR的失衡所致，而EphB2則通過(guò)調(diào)節(jié)NMDAR在突觸的表達(dá)及其下游的p38MAPK和CREB信號(hào)通路而對(duì)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷起到保護(hù)作用。本研究通過(guò)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，應(yīng)用MTT、LDH以及形態(tài)學(xué)方法，觀察Aβ1-42的神經(jīng)毒性損傷作用。以轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒的方法，提高海馬

8、神經(jīng)元內(nèi)EphB2的表達(dá)，進(jìn)而探討EphB2對(duì)于NMDAR在突觸的表達(dá)以及p38MAPK和CREB信號(hào)通路的影響。
　　 第一部分，EphB2對(duì)Aβ寡聚體誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷的保護(hù)作用
　　 目的:
　　 觀察Aβ1-42對(duì)海馬神經(jīng)元的毒性損傷作用以及對(duì)EphB2表達(dá)的影響，探討EphB2表達(dá)水平與Aβ1-42神經(jīng)毒性損傷間的關(guān)系。
　　 方法:
　　 新生1d內(nèi)SD乳鼠，剝離兩側(cè)海馬進(jìn)行體外培養(yǎng)，

9、培養(yǎng)至神經(jīng)元成熟以后，以NeuN神經(jīng)元特異性抗體和Hoechst33258雙染鑒定神經(jīng)元純度，神經(jīng)元純度在90％以上的用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)、Hoechst33258染色以及LDH和MTT檢測(cè)的方法，觀察1μMAβ1-42處理海馬神經(jīng)元1，3，6，24h后，對(duì)神經(jīng)元的毒性損傷作用。Westernblot檢測(cè)Aβ1-42對(duì)海馬神經(jīng)元內(nèi)EphB2表達(dá)水平的影響。進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，觀察EphB2對(duì)Aβ1-42神經(jīng)毒性損傷的

10、作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、原代培養(yǎng)的成熟海馬神經(jīng)元，胞體較大，周圍光暈明顯，胞漿飽滿，胞核大，神經(jīng)元突起交織成網(wǎng)絡(luò)。1μM的Aβ1-42處理1，3，6，24h后，神經(jīng)元數(shù)量隨Aβ1-42處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸減少的趨勢(shì)，部分細(xì)胞胞體腫脹，失去折光性，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒，有些胞膜破裂，有大量碎片生成。Hoechst33258染色顯示，隨著Aβ1-42處理時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元細(xì)胞核縮小，染色質(zhì)斷裂凝集顯著增多，熒光強(qiáng)度逐漸增加

11、。
　　 2、MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示，在Aβ1-42處理1，3，6，24h后，神經(jīng)元的存活率逐漸下降，與對(duì)照組相比，均存在顯著性差異。
　　 3、檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH釋放率，結(jié)果顯示，在Aβ1-42處理1，3，6，24h后，LDH釋放率隨Aβ1-42處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，與對(duì)照組相比，均存在顯著性差異。
　　 4、Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元后，顯著降低了EphB2的表達(dá)水平，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)

12、染EphB2質(zhì)粒，增加了海馬神經(jīng)元內(nèi)EphB2的表達(dá)，使Aβ1-42處理后的海馬神經(jīng)元內(nèi)EphB2的表達(dá)恢復(fù)到正常對(duì)照組水平。
　　 5、MTT和LDH檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理1h和3h后，細(xì)胞存活率升高，LDH釋放率下降，與單獨(dú)Aβ1-42處理1h和3h組相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ142處理6h和24h后，細(xì)胞存活率和LDH釋放率與單獨(dú)Aβ1-42處理6h和24h之間無(wú)顯著性差異。結(jié)果表

13、明在Aβ1-42毒性損傷早期，轉(zhuǎn)染EphB2具有保護(hù)作用，因此，后面相關(guān)實(shí)驗(yàn)Aβ1-42處理的時(shí)間均為1h。
　　 結(jié)論:
　　 Aβ1-42對(duì)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元具有時(shí)間依賴性的毒性損傷作用，同時(shí)，Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元后，細(xì)胞內(nèi)EphB2的表達(dá)水平下降。通過(guò)轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒增加神經(jīng)元內(nèi)EphB2的表達(dá)水平，能夠抑制Aβ1-42對(duì)海馬神經(jīng)元的毒性損傷作用。
　　 第二部分，EphB2對(duì)Aβ寡聚體誘導(dǎo)的NM

14、DAR在突觸表達(dá)改變的影響
　　 目的:
　　 觀察AD動(dòng)物模型SAMP8小鼠和AD細(xì)胞模型中NMDAR在突觸表達(dá)的變化，并在AD細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，探討EphB2對(duì)于NMDAR在突觸表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:
　　 以6月齡SAMP8小鼠作為AD動(dòng)物模型，通過(guò)生物化學(xué)方法，分離海馬突觸蛋白，檢測(cè)NMDAR各亞基在突觸表達(dá)的變化。Aβ1-42處理原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)的方法，

15、進(jìn)一步觀察在AD細(xì)胞模型中NMDAR各亞基在突觸表達(dá)的變化。再通過(guò)轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，增加AD細(xì)胞膜型中EphB2的表達(dá)，進(jìn)而觀察EphB2對(duì)于NMDAR各亞基在突觸表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、Westernblot結(jié)果顯示，NR1、NR2A和NR2B在突觸表達(dá)占NR1、NR2A和NR2B表達(dá)總量的比值在SAMP8、SAMR1和CD-1三組間存在顯著性差異，SAMP8小鼠顯著低于SAMR1和CD-1小鼠(P

16、＜0.01)，SAMR1和CD-1小鼠間沒(méi)有顯著性差異。
　　 2、Aβ1-42處理的原代海馬神經(jīng)元，應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)NMDAR三個(gè)亞基在突觸的表達(dá)變化。NR1、NR2A和NR2B在突觸表達(dá)的量占NR1、NR2A和NR2B表達(dá)總量的比值在對(duì)照組(Con)與Aβ1-42處理組(Aβ)間存在顯著差異，Aβ1-42處理使NR1、NR2A和NR2B在突觸的表達(dá)分別下降29.18％(P＜0.01)、17.98％(P＜0.01)和24.

17、67％(P＜0.01)。
　　 3、在海馬神經(jīng)元內(nèi)，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組(EphB2+Aβ)顯著增加了NR1和NR2B在突觸的表達(dá)，比單獨(dú)的Aβ1-42處理組(Aβ)分別增加17.95％(P＜0.01)和19.31％(P＜0.01)。NR2A在突觸的表達(dá)未受到轉(zhuǎn)染EphB2的顯著影響，在轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組(EphB2+Aβ)與單獨(dú)的Aβ1-42處理組(Aβ)之間無(wú)顯著性差異，仍顯著少于對(duì)照組(Con

18、)(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 AD動(dòng)物模型SAMP8小鼠，NR1、NR2A和NR2B在突觸的表達(dá)顯著下降。Aβ1-42處理的海馬神經(jīng)元也表現(xiàn)出NR1、NR2A和NR2B在突觸表達(dá)的顯著下降，轉(zhuǎn)染EphB2能抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的NR1和NR2B在突觸表達(dá)的降低，但對(duì)于NR2A在突觸的表達(dá)無(wú)顯著影響。
　　 第三部分，EphB2對(duì)Aβ寡聚體誘導(dǎo)的p38MAPK和CREB信號(hào)通路的影響
　　 目的

19、:
　　 探討EphB2在AD細(xì)胞模型中對(duì)于p38MAPK和CREB信號(hào)通路的影響。
　　 方法:
　　 Aβ1-42處理原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，應(yīng)用westemblot檢測(cè)p38MAPK和CREB的磷酸化水平。進(jìn)而通過(guò)轉(zhuǎn)染EphB2質(zhì)粒，增加AD細(xì)胞模型中EphB2的表達(dá)水平，觀察EphB2對(duì)于p38MAPK和CREB磷酸化水平的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、與對(duì)照組(Con)相比，p38MAP

20、K磷酸化水平在Aβ1-42處理組（Aβ）顯著升高(P＜0.01)，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組(EphB2+Aβ)和單獨(dú)轉(zhuǎn)染EphB2組(EphB2)與對(duì)照組間無(wú)顯著性差異。與Aβ1-42處理組(Aβ)相比，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組(EphB2+Aβ)的p38MAPK磷酸化水平顯著降低(P＜0.01)，轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒后Aβ1-42處理組(iEphB2+Aβ)與Aβ1-42處理組(Aβ)間無(wú)顯著性差異。
　　 2、與

21、對(duì)照組(Con)相比，CREB磷酸化水平在Aβ1-42處理組(Aβ)顯著降低(P＜0.01)，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組(EphB2+Aβ)和單獨(dú)轉(zhuǎn)染EphB2組(EphB2)與對(duì)照組間無(wú)顯著性差異。與Aβ1-42處理組(Aβ)相比，轉(zhuǎn)染EphB2后Aβ1-42處理組(EphB2+Aβ)的CREB磷酸化水平顯著升高(P＜0.01)，轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒后Aβ1-42處理組(iEphB2+Aβ)與Aβ1-42處理組（Aβ）間無(wú)顯著性差異。

22、
　　 結(jié)論:
　　 Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元后，p38MAPK磷酸化水平顯著升高，而CREB的磷酸化水平顯著降低。過(guò)表達(dá)EphB2能夠抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的p38MAPK磷酸化水平的升高和CREB磷酸化水平的降低。
　　 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以Aβ1-42處理原代海馬神經(jīng)元建立AD細(xì)胞模型，應(yīng)用形態(tài)學(xué)、MTT、LDH釋放率、免疫細(xì)胞化學(xué)、westernblot等方法，研究EphB2對(duì)于Aβ1-42神經(jīng)毒性的保護(hù)作

23、用及其可能機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)Aβ1-42對(duì)于海馬神經(jīng)元具有時(shí)間依賴性的神經(jīng)毒性作用，并導(dǎo)致EphB2表達(dá)水平的降低。在海馬神經(jīng)元內(nèi)過(guò)表達(dá)EphB2能夠抑制Aβ1-42對(duì)海馬神經(jīng)元的毒性損傷，且在Aβ1-42處理1h的時(shí)候，EphB2的保護(hù)作用最為顯著，因此，本實(shí)驗(yàn)采用Aβ1-42處理海馬神經(jīng)元1h的模型來(lái)研究EphB2的作用機(jī)制。Aβ1-42誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元內(nèi)NR1、NR2A和NR2B在突觸的表達(dá)顯著下降，過(guò)表達(dá)EphB2能夠抑制Aβ1-42

24、誘導(dǎo)的NR1和NR2B在突觸表達(dá)的降低，提示在Aβ1-42誘導(dǎo)的毒性損傷模型中，EphB2具有調(diào)節(jié)NMDAR在突觸表達(dá)的功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Aβ1-42誘導(dǎo)的p38MAPK的磷酸化升高以及CREB磷酸化的降低，都能夠通過(guò)增加EphB2的表達(dá)水平而得以恢復(fù)?？傊狙芯拷Y(jié)果提示EphB2通過(guò)提高NMDAR在突觸的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)突觸NMDAR下游信號(hào)通路p38MAPK和CREB的激活而對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性起到保護(hù)作用，初步揭示了