調控SIRT1-ARE-NRF2信號通路對PQ中毒小鼠肺損傷的保護作用.pdf

1、目的:氧化應激在百草枯（paraquat, PQ）中毒發(fā)病機制中的作用已得到廣泛認同，核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2）作為調節(jié)細胞內氧化-抗氧化平衡的關鍵轉錄因子參與PQ肺損傷的病理生理過程。研究其調節(jié)方式及機制將有助于深化對PQ中毒發(fā)病機制的認識。積累的資料表明，沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator1，Sirt1)可通過多種途

2、徑調節(jié)抗氧化分子的表達，并且與Nrf2的穩(wěn)定性和活性關系密切，有可能由此參與Nrf2介導的氧化應激的調節(jié)過程。本研究旨在通過體外實驗，證明Nrf2與Sirt1蛋白間存在相互作用的前提下，運用基因轉染技術調節(jié)二者的表達，探討Sirt1/ARE/Nrf2信號通路對于PQ中毒小鼠肺損傷的保護作用，為PQ中毒肺的抗氧化損傷治療提供理論依據(jù)。
　　方法:實驗一:培養(yǎng)小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮細胞，用PQ暴露后，利用免疫共沉淀技術(co-immun

3、oprecipitation，CO-IP)，分別以Nrf2和Sirt1作為一抗，正反驗證在氧化應激條件下，Nrf2蛋白與Sirt1蛋白是否具有相互作用;構建攜帶Nrf2和Sirt1基因的過表達慢病毒載體。實驗二:通過綠色熒光表達量驗證慢病毒載體的轉染效率，并以PCR和Western-blot技術分別從基因和蛋白水平檢測Nrf2及Sirt1的表達情況，進一步驗證過表達慢病毒載體構建。實驗三:利用骨髓間充質干細胞系(bone marrow

4、mesenchymal stem cells，BMSC)較強的遷移能力及向受損肺組織“歸巢”的特性，建立攜帶Nrf2、Sirt1的BMSC系，再用其對PQ中毒小鼠進行干預。145只ICR小鼠分為以下8組:①空白對照組②NS組③PQ組④PQ+NS組⑤PQ+LV-MSC-GFP組⑥PQ+LV-MSC-Nrf2組⑦PQ+LV-MSC-Sirt1組⑧PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirt1組。分別于PQ染毒后3d、7d、14d、21d麻醉處死，

5、每組每個時間點各5只，空白對照組直接麻醉處死，取肺組織。運用PCR和Western blot技術分別從基因和蛋白水平觀察Nrf2及Sirt1的動態(tài)改變;化學比色法檢測肺組織MDA、SOD、CAT、GSH含量或活性;ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β1水平;光鏡聯(lián)合透射電鏡觀察小鼠肺組織損傷情況。
　　結果:
　　1.CO-IP正反實驗表明，PQ暴露的Ⅱ型肺泡上皮細胞，Nrf2蛋白與Sirt1蛋

6、白有相互作用。
　　2.通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達情況，各過表達慢病毒載體轉染組轉染效率均在80％以上，LV-Nrf2和LV-Sirt1感染骨髓間充質干細胞后，PCR和Western-blot技術顯示LV-Nrf2和LV-Sirt1在感染的骨髓間充質干細胞中基因和蛋白表達量明顯升高(P＜0.01)。
　　3.空白對照組與NS組、PQ組與PQ+NS組數(shù)據(jù)高度類似，不再重復比較;PQ+LV-MSC-GFP組與PQ組無明顯差異

7、。
　　(1)與空白對照組比較，3d時，PQ組Nrf2、Sirt1基因及蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）;與PQ組比較，PQ+LV-MSC-GFP組Nrf2、Sirt1基因表達量基本無改變，而蛋白表達水平稍高，但無統(tǒng)計學意義; PQ+LV-MSC-Nrf2組、 PQ+LV-MSC-Sirt1組、PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirt1組Nrf2、Sirt1基因及蛋白表達量均明顯升高（P＜0.05），其中PQ+LV-MSC-Nrf

8、2/Sirt1組最高。隨著時間的推移，各組其表達量逐漸降低，至21d，PQ組較各干預組相比Sirt1和Nrf2的水平更低。
　　(2)肺組織勻漿中:與空白對照組比較，PQ組MDA含量明顯升高，SOD、CAT活性均較低，GSH含量下降;與PQ組比較，基因轉染干預后MDA含量明顯下降，SOD、CAT活性，GSH含量明顯升高。
　　(3) ELISA結果顯示:與空白對照組小鼠血清比較，PQ組3d時TNF-α、IL-1β、IL-10

9、、TGF-β1明顯升高(P＜0.05)，TNF-α、IL-1β升高的幅度整體高于IL-10、TGF-β1，隨著時間的推移，各炎癥因子含量逐漸下降，21d時，已與空白對照組差異不大;與PQ組比較，相同時間點，PQ+LV-MSC-Nrf2組、PQ+LV-MSC-Sirt1組、PQ+LV-MSC-Nrf2/Sirt1組TNF-α、IL-1β含量較低（P＜0.05），而IL-10、TGF-β1含量明顯升高（P＜0.05），其中PQ+LV-MSC

10、-Nrf2/Sirt1組干預效果最好。
　　(4) PQ染毒后，PQ小鼠出現(xiàn)倦怠少動，反應遲緩，毛色于枯，呼吸急促等表現(xiàn);采用Sirt1或Nrf2基因干預后均可明顯改善以上中毒癥狀，聯(lián)合Sirt1和Nrf2干預組與正常小鼠表現(xiàn)相似。PQ中毒小鼠的肺組織出現(xiàn)明顯的炎癥和出血，ACE-Ⅱ細胞損傷嚴重;采用Sirt1或/和Nrf2進行干預后明顯改善肺組織損傷和炎癥反應，利于ACE-Ⅱ修復。
　　結論:PQ中毒后小鼠肺組織Sirt1