EphrinB2-EphB4信號通路在炎性骨缺損愈合中的作用.pdf

1、背景與目的
　　目前，由炎癥、損傷、畸形和腫瘤等原因引起的口腔牙槽骨吸收與頜骨缺損是口腔科許多疾病最常見的臨床表現(xiàn)之一，嚴重影響人們的美觀、咀嚼、發(fā)音以及進一步的義齒修復(fù)。因此，如何調(diào)控骨重塑、恢復(fù)組織功能成為臨床和基礎(chǔ)研究的重點[1]。我們口腔科的常見病多發(fā)病之一牙周病就是其中的一種以牙槽骨吸收、牙齒松動脫落為主要特征的炎性骨代謝疾病。在牙周病的進程中，骨改建的兩大參與者成骨細胞和破骨細胞均浸浴于慢性炎性環(huán)境中，其功能都會受到不

2、同程度的影響。然而，雖然現(xiàn)有的研究對成骨細胞或者破骨細胞在炎性刺激過程中表現(xiàn)出的功能變化已有了較為清晰的認識，但這些研究大多是將成骨細胞（骨形成）或破骨細胞（骨吸收）各自作為獨立的個體分離開進行研究，因此缺乏在炎性環(huán)境刺激下，成骨細胞和破骨細胞之間在信息交流和互相調(diào)控等方面是否存在失衡的準確信息[2，3]。
　　關(guān)于成骨細胞和破骨細胞之間互相交流的分子信號通路，主要分為以下兩大通路:RANKL-RANK-OPG通路和EphrinB

3、2-EphB4信號通路。以往文獻中報道最多的是RANKL-RANK-OPG信號通路，而對另一通路知之甚少，在口腔領(lǐng)域的研究更少。EphrinB2-EphB4信號通路是2006年由Matsuo等首先報道的骨改建過程中成骨細胞-破骨細胞間信號傳遞的一條新通路，這條信號通路是通過破骨細胞表面表達的ephrinB2和成骨細胞表達的EphB4跨膜蛋白受體間產(chǎn)生雙向信號傳導(dǎo)從而實現(xiàn)信息的傳遞和互相調(diào)控。其作用機理簡言之，破骨細胞表面表達的NFATc

4、1的靶基因ephrinB2和成骨細胞表面表達的EphB4受體相結(jié)合產(chǎn)生雙向的信號傳遞，其中逆向信號由ephrinB2介導(dǎo)將信息傳入破骨細胞，并通過抑制c-Fos-NFATc1的活性從而抑制破骨細胞前體細胞分化為破骨細胞;另一方面，正向信號由EphB4介導(dǎo)通過增強RhoA的活性誘導(dǎo)成骨細胞的分化。ZhaoC的研究表明，通過在轉(zhuǎn)基因小鼠的成骨細胞中過度表達EphB4，骨基質(zhì)的沉積量被顯著增加[2]。由EphB4-ephrinB2參與的信號通

5、路在促進骨形成的同時限制了過度的骨吸收，因而對于維持骨改建的平衡起著至關(guān)重要的作用。
　　TNF-α是目前公認的炎性微環(huán)境中最重要的一種內(nèi)源性的炎性介質(zhì)，在炎癥過程中起著最基本的作用，也是牙周病發(fā)生發(fā)展過程中重要的介導(dǎo)因子。它的作用原理是通過激活靶細胞內(nèi)NF-kB通路和MAPKS通路如p38，ERK和JNK通路使細胞發(fā)生增殖、分化、炎癥等應(yīng)激反應(yīng)[4,5,6]。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是廣泛存在于真

6、菌、植物和動物等真核生物體內(nèi)一種序列特異性基因沉默，而小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)是RNA干擾的中間產(chǎn)物，它是通過外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA(ds RNA)，特異性結(jié)合了與其序列互補的mRNA，誘導(dǎo)該mRNA的降解，沉默該基因的表達，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默[7,8]。慢病毒載體是常用的介導(dǎo)RNA干擾的病毒載體之一，其優(yōu)點為既可以感染分裂期細胞，又可以感染非分裂期細胞，且不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，轉(zhuǎn)

7、染效率高，表達的持續(xù)時間較長，因此是基因沉默的有效工具[9,10]。
　　本研究采用慢病毒干擾載體降低小鼠體內(nèi)目的基因ephrinB2和EphB4的表達，研究ephrinB2和EphB4基因沉默后骨缺損處骨形成和骨吸收活動的變化，并進一步探討了ephrinB2-EphB4信號通路對炎性骨缺損愈合的作用及意義，以期為臨床研發(fā)新的牙周治療方法和牙周病新藥的研發(fā)開辟一條新思路，并為牙周病新藥的研發(fā)提供新的藥物作用靶點，因而具有重要的臨床

8、意義和科研價值。
　　材料與方法
　　第一部分小鼠炎性徽環(huán)境模型的構(gòu)建及對骨缺損愈合的影響
　　方法
　　雄性C57BL/6小鼠30只，體重18-20g，隨機分為3組:0.5μg/kg組(下頜骨缺損，隔日腹腔注射TNF-α0.5μg/kg)、3μg/kg組(下頜骨缺損，隔日腹腔注射TNF-α3μg/kg)和5μg/kg組(下頜骨缺損，隔日腹腔注射TNF-α5μg/kg)。于術(shù)后當天、3天、7天、10天、14天通過

9、小鼠的內(nèi)眥靜脈采血，酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血液中TNF-α的水平;36只雄性C57BL/6小鼠體內(nèi)建立下頜骨實驗性骨缺損，手術(shù)當天開始腹腔注射0、0.5、3或5μg/kg的TNF-α，隔天注射一次。于術(shù)后3天、7天、14天取缺損側(cè)的下頜骨組織，HE染色觀察骨缺損處新骨形成的情況。
　　結(jié)果
　　Elisa（酶聯(lián)免疫吸附實驗）結(jié)果顯示:0.5μg/kg腹腔注射組3天時血清中TNF-α的含量上升至1.50±0.25 ng/ml，1

10、4天時又降低至0.31±0.35 ng/ml，呈先上升后下降的趨勢;而3μg/kg組呈先上升后下降的趨勢，10天時小鼠血清中TNF-α的含量最高，但14天時又有所下降;5μg/kg組血清中TNF-α的含量隨時間呈現(xiàn)升高的趨勢，7天后達到穩(wěn)定的血藥濃度。因此，為了在小鼠體內(nèi)形成穩(wěn)定的炎性環(huán)境，我們選擇了5μ g/kg TNFα腹腔注射，隔天注射一次的方法用于后續(xù)的實驗。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后3天，0.5μg/kg組、3μg/kg組和5μg

11、/kg組新生骨量低于對照組（0μg/kg組），但四者無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05);術(shù)后7天和14天時，3μg/kg組和5μg/kg組缺損處的新生骨量顯著低于對照組(p＜0.05)，但0.5μg/kg組與對照組相比，新生骨量無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。
　　第二部分 EphrinB2和EphB4小干擾RNA慢病毒載體的構(gòu)建和包裝
　　方法
　　1.包含目的基因的siRNA干擾載體的構(gòu)建
　　委托ThermoFis

12、her Scientific公司合成含設(shè)計好的針對ephrinB2和EphB4干擾序列的單鏈DNA(single strand DNA， ssDNA)oligo，共8對，然后退火延伸形成互補雙鏈。用特異限制性內(nèi)切酶酶切干擾序列兩端所含酶切位點后，使用DNA連接酶接入酶切后的pcDNA6.2TM-GW/ EmGFP-miR載體上，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)染進入細菌感受態(tài)細胞，測序驗證。PCR反應(yīng)檢測ephrinB2和EphB4的mRNA水平，篩選干擾效率

13、最高的兩組干擾載體和慢病毒目的載體pLenti6.3/V5-DEST重組，以獲得含干擾序列的慢病毒表達載體。
　　2.慢病毒載體的包裝和滴度測定
　　擴增構(gòu)建完成的含有目的基因干擾序列的慢病毒表達載體，將其與三種包裝載體質(zhì)粒pLP1，pLP2和pLP/VSVG共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，包裝慢病毒并收集病毒原液，超速離心濃縮后，梯度稀釋法測定病毒的滴度，分裝保存?zhèn)溆谩?br>　　結(jié)果
　　1.包含目的基因的siRNA干擾

14、載體的構(gòu)建
　　DNA序列測定結(jié)果證明所插入的片段序列與合成序列完全一致，表明已成功構(gòu)建了針對ephrinB2和EphB4基因的干擾載體。轉(zhuǎn)染48小時后，PCR篩選結(jié)果顯示，針對目的基因ephrinB2，1＃干擾載體的基因沉默效果最佳(87％)，針對目的基因EphB4，2＃干擾載體的基因沉默效果最佳(77％)。所以我們選擇了ephrinB2 siRNA1＃和EphB4 siRNA2＃載體和慢病毒目的載體pLenti6.3/V5-D

15、EST進行重組，獲得含靶基因干擾序列的慢病毒表達載體。
　　2.慢病毒載體的包裝和滴度測定將Lenti-E21＃和Lenti-E42＃慢病毒感染HEK293T細胞，96小時后梯度稀釋法測定病毒的滴度，經(jīng)計算得知，Lenti-E21＃病毒的滴度為3.5*108TU/ml，Lenti-E42＃病毒的滴度為2.5*108TU/ml，分別命名為pLenti6.3-efnb2siRNA和pLenti6.3-ephb4siRNA，將慢病毒液稀

16、釋至1*108TU/ml，分裝保存于-80度備用。
　　第三部分 EphrinB2-EphB4信號通路對炎性環(huán)境下骨缺損愈合的影響
　　方法
　　選用6-8周齡健康雄性C57BL/6小鼠108只，隨機分成pLenti6.3-ctrl、pLenti6.3-efnb2siRNA和pLenti6.3-ephb4siRNA3組，建立下頜骨骨缺損，各組缺損內(nèi)分別注射5μl pLenti6.3-ctrl， pLenti6.3-ef

17、nb2siRNA和pLenti6.3-ephb4siRNA，隔日腹腔注射TNF-α5μg/kg，分別于術(shù)后7、14和21天取缺損側(cè)的小鼠下頜骨標本，Real-time PCR檢測骨缺損處ephrinB2和EphB4兩種因子以及成骨因子Runx2，Osterix，OC，ALP，BSP和骨吸收因子Nfatc1mRNA的表達;Western blot檢測Runx2和BSP蛋白的表達;HE染色觀察骨缺損處新骨形成的情況;免疫組化觀察Runx2和

18、OC在骨缺損處的定位和蛋白表達情況，并進行光密度值分析;TRAP染色觀察缺損處骨吸收情況并進行破骨細胞計數(shù)。
　　結(jié)果
　　Realtime-PCR結(jié)果顯示，實驗組（pLenti6.3-efnb2siRNA組和pLenti6.3-ephb4siRNA組）目的基因ephrinB2和EphB4的表達水平相對于對照組pLenti6.3-ctrl組在三個時間點（7天、14天和21天）均是顯著降低的（p＜0.05）;7天和14天時，p

19、Lenti6.3-ephb4組Runx2和Osterix mRNA表達顯著低于對照組(分別p＜0.01，p＜0.05)，而ALP mRNA的表達量在三個時間點均顯著低于對照組，晚期成骨因子OC和BSP mRNA的表達量在14天和21天時亦顯著低于對照組(分別p＜0.01，p＜0.05)，而Nfatc1（7天和14天）mRNA的表達顯著高于對照組（分別p＜0.01，p＜0.05）;Western blot結(jié)果顯示，Runx2和BSP蛋白表

20、達的結(jié)果與PCR分析相一致;HE染色發(fā)現(xiàn)，14天時，pLenti6.3-ephb4組新生骨量顯著低于對照組(p＜0.01);免疫組化結(jié)果顯示:Runx2和OC在小鼠的成骨細胞、骨細胞和成纖維細胞中均有廣泛的表達，光密度分析顯示Runx2和OC蛋白表達的結(jié)果與PCR分析相一致;TRAP染色結(jié)果表明:7天和14天時，pLenti6.3-ephb4siRNA組TRAP(+)破骨細胞數(shù)顯著高于對照組(分別p＜0.01，p＜0.05)，而pLen

21、ti6.3-efnb2siRNA組骨形成因子和骨吸收因子、缺損處的新生骨量以及破骨細胞計數(shù)與對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論
　　1.采用5μg/kg TNFα腹腔注射，隔天注射一次的方式，成功構(gòu)建了小鼠體內(nèi)穩(wěn)定的炎性環(huán)境模型。
　　2.成功構(gòu)建了針對目的基因ephrinB2和EphB4的穩(wěn)定高效的慢病毒載體:pLenti6.3-efnb2siRNA和pLenti6.3-ephb4siRNA，基因沉