EphrinB-EphB調(diào)控疼痛的信號(hào)通路研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 PKA介導(dǎo)ephrinB-EphB信號(hào)相關(guān)的脊髓傷害性信息的調(diào)制
　　研究目的:
　　研究表明，EphB受體以及它的配體eprinB參與脊髓水平傷害性信息的處理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中，我們探討了蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)是否作為其下游的效應(yīng)分子，進(jìn)而介導(dǎo)ephrinB-EphB信號(hào)相關(guān)的脊髓傷害性信息的調(diào)制。
　　研究方法:
　　我們使用雄

2、性C57BL/6小鼠來(lái)檢測(cè)PKA催化亞基(PKAca)的表達(dá)、磷酸化的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（p-cAMP-response element binding protein，p-CREB）、熱痛覺(jué)過(guò)敏以及機(jī)械痛覺(jué)異常。PKA的一個(gè)抑制劑H89則被用來(lái)探討PKA在ephrinB-EphB信號(hào)相關(guān)的脊髓傷害性信息調(diào)制中的作用。
　　研究結(jié)果:
　　鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc能夠引起小鼠熱痛覺(jué)過(guò)敏以及機(jī)械痛覺(jué)異常，并且伴隨著

3、脊髓PKAca以及p-CREB的表達(dá)增加。預(yù)先給予PKA的抑制劑H89阻斷了由于鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc引起的脊髓CREB蛋白的激活。抑制脊髓的PKA信號(hào)能夠阻斷和逆轉(zhuǎn)小鼠由于鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc引起的疼痛行為。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)鞘內(nèi)注射EphB2-Fc來(lái)阻斷EphB受體能夠減輕formalin引起的炎性疼痛、坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷（chronic constriction injury，CCI）引起的神經(jīng)病理性疼痛

4、、以及脛骨骨腔種植腫瘤細(xì)胞引（tibia bone cavity tumor cell implantation，TCI）起的骨癌痛的疼痛行為。并且這種疼痛減輕的同時(shí)，伴隨著脊髓PKAca以及p-CREB的表達(dá)下降。
　　研究結(jié)論:
　　這些結(jié)果證明了PKA參與ephrinB-EphB信號(hào)相關(guān)的脊髓傷害性信息的調(diào)制的過(guò)程。這一結(jié)果可能對(duì)于探討ephrinB-EphB信號(hào)在生理和病理性疼痛中的作用機(jī)制具有重要的提示作用。

5、>　　第二部分 EphrinB-EphB信號(hào)通過(guò)PKCγ調(diào)控脊髓疼痛信息處理過(guò)程
　　研究目的:
　　脊髓水平ephrinB-EphB信號(hào)參與調(diào)控疼痛信息的處理過(guò)程。本研究深入探討了蛋白激酶C-γ亞型（PKCγ）是否作為一個(gè)下游的效應(yīng)分子，進(jìn)而介導(dǎo)ephrinB-EphB信號(hào)相關(guān)的脊髓傷害性信息的調(diào)制。
　　研究方法:
　　我們分別使用輻射熱源以及von-Frey細(xì)絲來(lái)檢測(cè)小鼠的熱痛覺(jué)過(guò)敏以及機(jī)械痛覺(jué)異常情況。免

6、疫印跡(western blot)分析用來(lái)檢測(cè)PKCγ的表達(dá)。靶向的PKCγ小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)用來(lái)探討PKCγ是否參與ephrinB-EphB信號(hào)相關(guān)的脊髓傷害性信息的調(diào)制。
　　研究結(jié)果:
　　鞘內(nèi)注射EphB受體的激動(dòng)劑ephrinB2-Fc能夠引起小鼠熱痛覺(jué)過(guò)敏以及機(jī)械痛覺(jué)異常，同時(shí)還使脊髓PKCγ的活化增加。基因沉默脊髓水平的PKCγ阻斷了由鞘內(nèi)注射ephrinB

7、2-Fc引起的該疼痛行為。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射EphB受體的阻斷劑EphB2-Fc，能夠抑制formalin引起的炎性疼痛、CCI引起的神經(jīng)病理性疼痛、以及TCI引起的骨癌痛的疼痛行為。除此之外，這些疼痛減輕的同時(shí)還伴隨著脊髓PKCγ的表達(dá)下降。最后，鞘內(nèi)注射MK801，一種N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體的阻滯劑，能夠顯著的減輕ephrinB2-Fc引起的疼痛行為以及脊髓P

8、KCγ的激活。
　　研究結(jié)論:
　　總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果證明了PKCγ在ephrinB-EphB信號(hào)相關(guān)的脊髓傷害性信息的調(diào)制中發(fā)揮重要作用。
　　第三部分 PLCγ1參與EphrinB-EphB信號(hào)相關(guān)的脊髓疼痛信息的處理
　　研究目的:
　　脊髓水平的ephrinB-EphB信號(hào)參與調(diào)控疼痛信息的處理過(guò)程。本研究探討了磷脂酶C-γ1亞型（PLCγ1）是否作為一個(gè)下游的效應(yīng)分子參與ephrinB-EphB信

9、號(hào)相關(guān)的脊髓疼痛信息的處理。
　　研究方法:
　　輻射熱源以及von-Frey細(xì)絲被分別用來(lái)檢測(cè)小鼠的熱痛覺(jué)過(guò)敏以及機(jī)械痛覺(jué)異常情況。Western blot用來(lái)檢測(cè)PLCγ1的表達(dá)。靶向的PLCγ1小干擾RNA則用來(lái)檢測(cè)PLCγ1是否參與ephrinB-EphB信號(hào)相關(guān)的脊髓傷害性信息的處理。
　　研究結(jié)果:
　　鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc（EphB受體的激動(dòng)劑）能夠引起小鼠熱痛覺(jué)過(guò)敏以及機(jī)械痛覺(jué)異常，同時(shí)

10、還使脊髓PLCγ1的活化程度增加?；虺聊顾杷降腜LCγ1阻斷了由鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc引起的小鼠疼痛行為。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射EphB2-Fc（EphB受體的阻斷劑）能夠抑制formalin引起的炎性疼痛以及CCI引起的神經(jīng)病理性疼痛行為，同時(shí)，還伴隨著脊髓PLCγ1的活化下降。
　　研究結(jié)論:
　　總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果證明了PLCγ1參與了ephrinB-EphB信號(hào)相關(guān)的脊髓傷害性信息的處理過(guò)程。

11、　　第四部分 COX-2參與EphrinB-EphB信號(hào)相關(guān)的脊髓傷害性信息的調(diào)控
　　研究目的:
　　EphB受體以及它的配體eprinB參與脊髓水平傷害性信息的處理過(guò)程。本研究中，我們探討了環(huán)氧酶2（cyclo-oxygen-ase-2，COX-2）是否作為其下游的效應(yīng)分子，進(jìn)而介導(dǎo)了ephrinB-EphB信號(hào)相關(guān)的脊髓傷害性信息的調(diào)制。
　　研究方法:
　　輻射熱源以及von Frey細(xì)絲被分別用來(lái)檢測(cè)小

12、鼠的熱痛覺(jué)過(guò)敏以及機(jī)械痛覺(jué)異常情況。實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)用來(lái)檢測(cè)脊髓COX-2的表達(dá)。脊髓COX-2以及胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulated kinas，ERK）蛋白的表達(dá)情況則由western blot來(lái)檢測(cè)。
　　研究結(jié)果:
　　鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc能夠引起小鼠熱

13、痛覺(jué)過(guò)敏以及機(jī)械痛覺(jué)異常，并且伴隨著脊髓COX-2的mRNA以及蛋白的表達(dá)增加。抑制脊髓的COX-2信號(hào)能夠阻斷和逆轉(zhuǎn)了由鞘內(nèi)注射ephrinB2-Fc引起的小鼠疼痛行為。通過(guò)鞘內(nèi)注射EphB2-Fc阻斷EphB受體，能夠減輕完全弗氏佐劑(CFA)引起的炎性疼痛行為，同時(shí)脊髓COX-2的mRNA以及蛋白也相應(yīng)的表達(dá)下降。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，給予U0126，一種有絲分裂原活化蛋白/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated pro