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文檔簡介
1、第一部分
目的:本實驗課題以Balb/c小鼠的胚胎主動脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonad-mesonephros region, AGM region),胎肝(fetAlliver, FL)以及小鼠骨髓(bone marrow, BM)為研究對象,研究Shh、Wnt信號通路調(diào)控不同發(fā)育階段、不同造血部位來源的c-kit+造血祖細胞生物學(xué)特性的時空變化。
方法:采用磁珠分選法分離Balb/c小鼠孕10.5
2、天 (E10.5)AGM區(qū)、E14.5 FL以及BM來源c-kit+造血祖細胞,貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)小鼠E14.5 FL來源的基質(zhì)細胞。用流式細胞術(shù)檢測小鼠胚胎AGM區(qū)(E10.5, E11.5)、FL (E12.5, E14.5, E16.5, E18)以及BM來源的單個核細胞中c-kit+造血祖細胞的所占比例。建立體外以FL來源基質(zhì)細胞為飼養(yǎng)層的Transwell共培養(yǎng)體系,比較在基質(zhì)細胞支持造血的培養(yǎng)條件下,不同來源的c-kit+造
3、血祖細胞體外增殖、遷移以及集落形成能力。
結(jié)果:流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn):相對于BM,E10.5 AGM區(qū)和E12.5 FL中c-kir+造血祖細胞所占比例較高。通過體外集落形成能力分析,AGM區(qū)來源c-kit+造血祖細胞具有較強的形成混合集落形成單位(CFU-Mix)集落的能力;FL、BM來源c-kit+細胞則形成更多粒單系集落形成單位(CFU-GM)集落。進行體外Transwell共培養(yǎng),AGM區(qū)來源的c-kit+造血祖細胞
4、具有較強的增殖潛能,骨髓來源的c-kit+造血祖細胞的增殖能力最弱;AGM區(qū)和FL來源的c-kit+造血祖細胞比BM來源的c-kit+造血祖細胞在體外培養(yǎng)中具有更強的趨化遷移能力。
結(jié)論:和FL、BM來源的c-kit+造血祖細胞相比,AGM區(qū)來源c-kit+造血祖細胞具有更強的體外增殖和趨化遷移能力,在未來可能有著更廣闊的應(yīng)用前景。
第二部分
目的:本實驗課題以Balb/c小鼠的不同發(fā)育階段的胚
5、胎主動脈-性腺-中腎區(qū)(AGM region),胎肝(FL)以及小鼠骨髓(BM)為研究對象,研究Shh、Wnt信號通路調(diào)控不同發(fā)育階段、不同造血部位來源的c-kit+造血祖細胞生物學(xué)特性的時空變化。
方法:采用磁珠分選法分離Balb/c小鼠AGM區(qū)(孕10.5天、孕11.5天) (E10.5、E11.5)、FL(E12.5、E14.5、E16.5、E18)以及BM來源c-kit+造血祖細胞。用實時定量PCR的方法(Real
6、-time PCR)檢測Shh、Wnt信號通路相關(guān)基因Shh、Wnt3a在不同來源的c-kit+造血祖細胞中的動態(tài)表達。用免疫熒光檢測Shh蛋白和Wnt3a蛋白在造血組織及c-kit+造血祖細胞中的表達。體外培養(yǎng)骨髓來源c-kit+造血祖細胞,對培養(yǎng)體系進行不同干預(yù)分組:(1)對照組;(2)Shh組(0.5 ug/ml);(3)cyclopamine(Shh通路抑制劑)組(0.5 ug/ml);(4)Shh+cyclopamine組;通
7、過細胞計數(shù)以及集落培養(yǎng),比較Shh調(diào)控下c-kit+造血祖細胞的增殖能力。
結(jié)果:Shh和Wnt信號通路在造血發(fā)育過程中呈現(xiàn)著動態(tài)變化。 Shh、Wnt3a在胚胎E10.5 AGM的c-kit+造血祖細胞中有較高表達,而在骨髓來源c-kit+造血祖細胞中的表達則最弱。骨髓c-kit+造血祖細胞的體外增殖可被Shh通路拮抗劑cyclopamine抑制。外源性的Shh肽可以明顯促進骨髓c-kit+造血祖細胞增殖,促進細胞周期蛋
8、白Cyclin D1表達增高,Wnt信號通路上下游靶基因wnt3a、wnt5a、c-myc表達增高;而在cyclopamine(0.5 ug/ml)的作用下,外源肽Shh對Wnt信號通路以及細胞增殖的活化作用均可被阻斷。
結(jié)論:我們的研究發(fā)現(xiàn),c-kit+造血祖細胞的體外增殖能力可能與其自身的Shh、Wnt信號通路的活化程度有關(guān)。Shh信號通路可通過促進Wnt信號通路活化,從而參與調(diào)控造血祖細胞增殖。
第三部
9、分
目的:以小鼠胚胎孕10.5 d(E10.5)AGM區(qū),E12.5、E14.5胎肝以及小鼠骨髓來源的基質(zhì)細胞為研究對象,探討造血發(fā)育過程中Shh和Wnt信號通路參與造血微環(huán)境調(diào)控造血祖細胞增殖的機制。
方法:磁珠分選法分離小鼠骨髓來源的c-kit+造血祖細胞。貼壁培養(yǎng)法分離小鼠E10.5 AGM區(qū)、E12.5、E14.5胎肝以及骨髓來源的基質(zhì)細胞。建立體外以基質(zhì)細胞為飼養(yǎng)層的Transwell共培養(yǎng)體系,通
10、過細胞計數(shù),比較不同來源基質(zhì)細胞支持造血的能力。通過Real-time PCR和免疫熒光動態(tài)檢測各個發(fā)育階段來源的基質(zhì)細胞中Shh、Wnt信號通路基因及蛋白的表達水平。
結(jié)果:體外培養(yǎng)7天,AGM區(qū)來源的基質(zhì)細胞培養(yǎng)體系中c-kit+造血祖細胞數(shù)增長了近50倍,胎肝來源的基質(zhì)細胞培養(yǎng)體系中c-kit+造血祖細胞數(shù)增長了(60-80)倍,均明顯高于以骨髓基質(zhì)細胞為飼養(yǎng)層的Transwell共培養(yǎng)體系中的細胞增長量(22.9±
11、4.5)倍(P<0.05)。AGM區(qū)、胎肝、骨髓來源的基質(zhì)細胞均表達Shh、Wnt3a、Wnt5a。Shh和Wnt信號通路在胚胎發(fā)育過程中更為活化。Shh在AGM區(qū)來源基質(zhì)細胞中的表達是骨髓來源基質(zhì)細胞的(3.4±0.45)倍,在胎肝來源基質(zhì)細胞中的表達是骨髓來源基質(zhì)細胞中的表達量的(11.8±2.3)倍(P<0.05)。Wnt3a和Wnt5a在E10.5 AGM區(qū)來源的基質(zhì)細胞中的基因表達量是骨髓來源基質(zhì)細胞的(13.6±2.1)倍,
12、隨著胚胎發(fā)育,wnt3a和wnt5a的表達逐漸下降,在E14.5胎肝來源基質(zhì)細胞中的表達亦再次增高,為骨髓基質(zhì)細胞的(9.56±1.14)倍(P<0.05)。免疫熒光提示Shh蛋白在胚胎期明顯高表達,尤其是在胎肝。Wnt信號通路的核心轉(zhuǎn)錄分子β-catenin蛋白在不同來源的基質(zhì)細胞中具有表達,其中以胚胎期E10.5 AGM區(qū)以及E14.5胎肝來源基質(zhì)細胞的表達強度最高,并且具有明顯的核內(nèi)累積現(xiàn)象。
結(jié)論:造血發(fā)育過程中,
13、造血微環(huán)境中基質(zhì)細胞通過Shh與Wnt信號通路協(xié)作、交替、整合作用,精密調(diào)控造血祖細胞的增殖。
第四部分
目的:探索Shh、Wnt信號通路調(diào)控c-kit+造血祖細胞增殖的機制。
方法:c-kit抗體偶聯(lián)磁珠分選法分離小鼠骨髓來源的造血祖細胞。采用貼壁培養(yǎng)法分離小鼠孕14.5d (E14.5)胎肝來源的基質(zhì)細胞。將E14.5胎肝基質(zhì)細胞作為飼養(yǎng)層,與c-kit+造血祖細進行Transwell共培養(yǎng)
14、體,通過細胞計數(shù)繪制c-kit+造血祖細胞生長曲線。對體外Transwell共培養(yǎng)的c-kit+造血祖細胞進行不同干預(yù)分組:(1)對照組;(2)Shh處理組(0.5 ug/ml);(3)cyclopamine處理組(Shh通路抑制劑)(0.5 ug/ml);(4)Shh+cyclopamine處理組;通過細胞計數(shù)以及集落培養(yǎng),比較不同培養(yǎng)條件下c-kit+造血祖細胞增殖的能力。通過Real-time PCR檢測Shh調(diào)控下Wnt信號通路
15、的核心分子Wnt3a、Wnt5a、信號通路靶基因c-myc以及細胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1的表達。
結(jié)果:E14.5胎肝來源基質(zhì)細胞可明顯促進骨髓c-kit+造血祖細胞增殖。Transwell培養(yǎng)體系中骨髓c-kit+造血祖細胞的增殖效應(yīng)可被Shh通路拮抗劑cyclopamine抑制。在Transwell共培養(yǎng)體系中,外源性的Shh肽可以明顯促進c-kit+造血祖細胞增殖,Wnt信號通路上下游靶基因wnt3a、wnt5
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