Vaspin在骨性關(guān)節(jié)炎中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 Vaspin在正常人群和OA人群中的表達(dá)特性
　　目的:
　　觀察vaspin在膝關(guān)節(jié)內(nèi)組織的表達(dá)情況;觀察vaspin在正常人群和OA人群中的表達(dá)差異。
　　方法:
　　取膝關(guān)節(jié)OA患者全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)(Total knee arthroplasty, TKA)后的膝關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、半月板、脂肪墊和骨贅等標(biāo)本，用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasecha

2、in reaction，PCR)法檢測(cè)各組織中vaspin的基因表達(dá)，用免疫組織化學(xué)方法(Immunohistochemistry, IHC)檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨、滑膜和骨贅中vaspin的蛋白表達(dá)和分布。用酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)觀察23例正常人群和26例OA人群血清中vaspin的含量差異。
　　結(jié)果:
　　膝關(guān)節(jié)內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、半月板、脂肪墊和骨贅等

3、組織中均檢測(cè)出vaspin基因表達(dá)。在軟骨退變嚴(yán)重，滑膜增生明顯以及骨贅形成區(qū)域vaspin表達(dá)更加明顯。OA患者血清vaspin水平較正常人群顯著下降(18.5±11.1 pg/mL vs26.3±9.6pg/mL，p=0.01)。
　　結(jié)論:
　　Vaspin在關(guān)節(jié)內(nèi)各組織中均有表達(dá)，在退變嚴(yán)重區(qū)域表達(dá)豐富，OA人群血清vaspin水平較正常人群顯著下降，提示vaspin與OA疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)。
　　第二

4、部分 Vaspin對(duì)培養(yǎng)軟骨細(xì)胞具有抗炎抗降解作用
　　目的:
　　觀察vaspin對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的毒性作用;觀察vaspin拮抗IL-1β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥降解作用。
　　方法:
　　取4周齡(Sprague-Dawley, SD)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)后傳至3代穩(wěn)定。用不同濃度的vaspin(10-500ng/ml)處理軟骨細(xì)胞24和48小時(shí)，用細(xì)胞計(jì)數(shù)活性法(Cell counting

5、 kit-8，CCK-8)檢測(cè)軟骨細(xì)胞的分化活性;用不同濃度vaspin干預(yù)IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞，用時(shí)定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP-2，MMP-9，ADAMTS-4和ADAMTS-5的基因表達(dá)變化，用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中COX-2，PGE2和iNOS的含量變化。
　　結(jié)果:
　　Vaspin在濃度到達(dá)500ng/ml時(shí)不會(huì)對(duì)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。Vaspin抑制IL-1β介導(dǎo)的體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP-2，

6、MMP-9和ADAMTS-5的基因表達(dá)，同時(shí)也減少細(xì)胞上清液中COX-2，PGE2和iNOS的含量。
　　結(jié)論:
　　Vaspin在濃度達(dá)500ng/ml時(shí)對(duì)軟骨細(xì)胞無毒性作用;vaspin對(duì)體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞具有抗炎癥抗降解作用。
　　第三部分 Vaspin拮抗IL-1β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥降解作用的分子機(jī)制研究
　　目的:
　　觀察vaspin拮抗IL1β介導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎癥降解作用的分子機(jī)制。
　

7、　方法:
　　取4周齡SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)后傳至3代穩(wěn)定。用10ng/ml的IL-1β預(yù)處理1小時(shí)后，加入不同濃度vaspin24小時(shí)，使用Western blot檢測(cè)軟骨細(xì)胞中磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子(p-nuclear factor kappa B，p-NF-κB)和轉(zhuǎn)錄抑制因子(Inhibitor of nuclear factor kappa B，IκBα)的表達(dá)。在軟骨細(xì)胞中加入NF-κB信號(hào)通路抑制劑BAY11-

8、7082（1μM）預(yù)處理1小時(shí)，再加入IL-1β10ng/ml培育24小時(shí)，用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中COX-2，PGE2和iNOS的含量變化。
　　結(jié)果:
　　Vaspin顯著抑制了軟骨細(xì)胞中IL-1β介導(dǎo)的NF-κB的磷酸化和IκBα的降解。NF-κB信號(hào)通路抑制劑BAY11-7082顯著降低了IL-1β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞上清液中COX-2，PGE2和iNOS的含量。
　　結(jié)論:
　　Vaspin可以通過抑制

9、NF-κB信號(hào)通路拮抗IL-1β介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥降解作用。
　　第四部分 Vaspin拮抗IL-1β介導(dǎo)動(dòng)物關(guān)節(jié)腔內(nèi)軟骨降解作用的觀察
　　目的:
　　觀察vaspin拮抗IL-1β介導(dǎo)動(dòng)物關(guān)節(jié)腔內(nèi)軟骨降解作用。
　　方法:
　　取40只3月齡雄性SD大鼠(250g)，用膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射動(dòng)物模型。隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常對(duì)照組，50μg IL-1β組，50μg vaspin組和50μg IL-1

10、β+50tg vaspin組，正常組不行關(guān)節(jié)腔注射，其余各組動(dòng)物注射藥物48小時(shí)后處死，取膝關(guān)節(jié)（脛骨側(cè)）標(biāo)本，用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨中MMP-2，MMP-9，ADAMTS-4和ADAMTS-5的基因表達(dá)，并使用番紅-固綠染色觀察軟骨內(nèi)蛋白多糖(Proteoglycan，PG)的含量變化。
　　結(jié)果:
　　Vaspin顯著抑制關(guān)節(jié)軟骨中IL-1β介導(dǎo)的MMP-2，MMP-9和ADAMTS-5基因表達(dá)。Vaspin對(duì)關(guān)