硫化氫在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、本文對硫化氫在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：
　　目的：探討H2S對兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)軟骨退變的影響。為H2S預(yù)防骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生提供理論依據(jù)。
　　方法：將32只新西蘭大白兔隨機(jī)分為四組，A組：空白對照組、B組：模型對照組、C組：H2S治療組、D組：抑制H2S生成組，每組8只。A組不做任何處理，B、C、D組應(yīng)用改良的Hulth法制作兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型。術(shù)

2、后B組給予膝關(guān)節(jié)腔注射生理鹽水，每周一次，連續(xù)6周。術(shù)后C組膝關(guān)節(jié)腔給予注射60μM的NaHS稀釋液1ml，每周一次，連續(xù)6周。術(shù)后D組膝關(guān)節(jié)腔給予注射CBS酶抑制劑，每周一次，連續(xù)6周。術(shù)后7周處死動物。在處死動物之前，抽取膝關(guān)節(jié)液，采用Griess法及ELISA法分別檢測關(guān)節(jié)液中NO和PGE2的含量。處死動物之后，切取關(guān)節(jié)軟骨，行HE染色，光鏡下根據(jù)Mankin’s關(guān)節(jié)軟骨評分系統(tǒng)，進(jìn)行評分，比較各組間差異；通過免疫組化的方法檢測關(guān)

3、節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)情況；采用Real-time PCR的方法檢測關(guān)節(jié)軟骨中iNOS、COX-2、MMP-13 mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：光鏡下：A組關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)正常；B組的關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)膠原纖維排列紊亂，關(guān)節(jié)退變嚴(yán)重；C組關(guān)節(jié)軟骨退變程度降低；D組關(guān)節(jié)軟骨退變程度加重。Mankin’s評分顯示：同A組相比，B、C、D組評分均增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；H2S治療后（C組）能夠降低OA的Mankin’s評分

4、，抑制H2S生成（D組）Mankin’s評分增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。骨性關(guān)節(jié)炎組（B組）關(guān)節(jié)液中NO、PGE2的表達(dá)增多；H2S治療后（C組）能夠降低OA關(guān)節(jié)液中NO、PGE2的表達(dá)量；抑制H2S生成（D組） OA關(guān)節(jié)液中NO、PGE2的表達(dá)量增加；差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅱ型膠原蛋白染色顯示：同正常組（A組）相比，骨性關(guān)節(jié)炎組（B組）Ⅱ型膠原蛋白陽性染色顯著降低，分布不均勻；H2S治療后（C組）Ⅱ型膠原蛋白陽性染色增加，

5、表達(dá)增多；抑制H2S生成（D組）Ⅱ型膠原蛋白陽性染色顯著降低且表淺層出現(xiàn)缺損；差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。H2S治療后，與模型對照組比較，關(guān)節(jié)軟骨中iNOS、COX-2、MMP-13mRNA的表達(dá)降低；抑制H2S生成后，iNOS、COX-2、MMP-13 mRNA的表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：⑴H2S抑制兔骨性關(guān)節(jié)炎的膝關(guān)節(jié)液中NO與PGE2的生成。⑵H2S抑制兔骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨中的Ⅱ型膠原纖維的降解。⑶

6、H2S抑制兔骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨中的iNOS、COX-2、MMP-13mRNA的表達(dá)。
　　第二部分：
　　目的：研究硫化氫對IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。
　　方法：通過IL-1β刺激軟骨細(xì)胞來模擬骨性關(guān)節(jié)炎的體內(nèi)炎癥狀態(tài)。軟骨細(xì)胞預(yù)先經(jīng)不同濃度的硫化氫（0.06–1.5 mM）處理，然后給予IL-1β（10 ng/ml）處理。通過Griess檢測試劑盒檢測NO的表達(dá)情況，酶聯(lián)免疫吸附法檢測PGE2及MM

7、P-13的表達(dá)情況；通過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測iNOS、COX-2、MMP-13的基因表達(dá)情況；絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路及細(xì)胞核因子-κB（NF-κB）信號通路的調(diào)節(jié)作用采用Western blot的方法檢測。
　　結(jié)果：IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞表達(dá)iNOS、COX-2、MMP-13的mRNA，從而增加軟骨細(xì)胞分泌NO、PGE2和MMP-13。硫化氫抑制IL-1β對軟骨細(xì)胞的這種損傷作用。IL-1β促進(jìn)MAPKs通