抗體中和Aβ寡聚體后對激活的BV2細胞P38信號通路及IL-1β的影響.pdf

1、研究背景：
　　Alzheimer病(Alzheimer's disease，AD)是一種病因不明的神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病，組織病學表現(xiàn)為老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFT)等。隨著老化的進展，AD的發(fā)病事逐漸升高。對其機制的研究一直在進展，其中小膠質(zhì)細胞在AD發(fā)生發(fā)展中的作用一直是備受爭議的熱點。
　　正常情況下，腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞主要通過吞噬淀粉樣纖維對淀粉樣蛋白(beta amy

2、loid，Aβ)引起的神經(jīng)元丟失起到保護作用。活化的小膠質(zhì)細胞能清除神經(jīng)系統(tǒng)中的死亡細胞，并且分泌幫助神經(jīng)元存活的神經(jīng)營養(yǎng)因子，但在AD等神經(jīng)退變性疾病的微環(huán)境中，小膠質(zhì)細胞異常激活后就往往變得難以控制，表現(xiàn)出形態(tài)和功能的可塑性，最終轉化為巨噬細胞的原型，包括形態(tài)變化、產(chǎn)生多種免疫炎性和神經(jīng)毒性因子，對神經(jīng)細胞和其他膠質(zhì)細胞產(chǎn)生影響?；罨男∧z質(zhì)細胞已成為各種神經(jīng)元退行性變包括AD的重要病理標志。本研究通過抑制激活的BV2小膠質(zhì)細胞，探

3、討去除Aβ刺激后小膠質(zhì)細胞是否能持續(xù)介導炎癥反應。
　　大量研究顯示Aβ淀粉樣蛋白能改變小膠質(zhì)細胞的活性，細胞膜受體及信號通路在這個過程中起到重要作用。不同的細胞膜受體，包括CD36、α6β1整合素、CD14、TLR2、P2X7受體，與Aβ結合，激活P38MAPK信號通路導致小膠質(zhì)細胞的活化，上調(diào)炎癥因子IL-1β的產(chǎn)生，炎癥因子又可活化P38MAPK信號通路，造成惡性循環(huán)。
　　雖然淀粉樣蛋白級聯(lián)假說是目前最廣為接受的AD

4、發(fā)病假說，越來越多的學者研究發(fā)現(xiàn)即使使用AD疫苗減少小鼠腦中Aβ沉積含量，其神經(jīng)退行性變依然持續(xù)存在且不斷進展惡化，使得人們開始從間接激活損傷的角度開始懷疑。因此探討激活的小膠質(zhì)細胞對神經(jīng)系統(tǒng)退行性交的影響顯得尤為重要。
　　目的：
　　觀察體外培養(yǎng)條件下人工合成的抗Aβ1-42抗體對用淀粉樣蛋白寡聚體激活的BV2細胞P38MAPK通路表達及IL-1β的作用。以探討抑制激活的小膠質(zhì)細胞對P38表達及炎癥反應的影響，觀察在去除

5、Aβ1-42的刺激后信號通路活性及細胞炎癥因子IL-1β濃度變化。
　　方法：
　　培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細胞;按William L.Klein(2002)方法制備Aβ1-42寡聚體(ADDLs)備用;倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化;使用ELISA試劑盒檢測細胞上清中細胞因子IL-1β水平;WESTERN BLOT檢測BV2細胞中總P38與磷酸化P38蛋白表達含量。
　　結果：
　　1、倒置顯微光鏡下觀察BV2細胞形態(tài)學

6、變化
　　(1)空白對照組中BV2細胞形態(tài)未見明顯改變;
　　(2)BV2細胞激活組培養(yǎng)液中加入2umol/l的ADDLs作用6小時后細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯改變，細胞皺縮變圓，突觸變短，細胞間隙變大;
　　(3)待ADDLs作用6小時后加入抗Aβ1-42抗體中和，繼續(xù)作用6小時發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)依然在持續(xù)皺縮，但在相同時間點較激活組皺縮程度輕;。
　　(4)繼續(xù)觀察激活組與抗體組12、18、24小時發(fā)現(xiàn)，抗體組細胞形態(tài)及細胞

7、間隙改變在相同時間點較激活組輕，但較空白組細胞形態(tài)仍未見明顯改善，推測細胞損傷在持續(xù)進行中。
　　2、ELISA法測細胞上清IL-1β濃度
　　(1)在空白對照組中，IL-1β濃度較低，不隨時間發(fā)生變化;
　　(2)在激活組中，IL-1β濃度明顯高于對照組(P＜0.05)，IL-1β濃度隨時間先上升后下降;
　　(3)在抗體組中，IL-1β濃度明顯高于對照組(P＜0.05)，IL-1β濃度隨時間先上升后下降;

8、r>　　(4)激活組與抗體組IL-1β濃度無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，提示抗Aβ1-42抗體并不能阻止炎癥反應組。
　　3、WESTERN BLOT法檢測BV2細胞磷酸化P38與總P38表達
　　(1)對照組中總P38蛋白與磷酸化P38蛋白表達隨時間無明顯變化;
　　(2)在激活組中磷酸化P38灰度隨時間先增強下降，總P38蛋白的量與空白組無明顯變化(P＞0.05);
　　(3)在抗體組中磷酸化P38灰度明

9、顯低于激活組(P＜0.05)，高于空白組，且隨時間先上升后下降，總P38蛋白表達與對照組相同。
　　結論：
　　(1)淀粉樣蛋白寡聚體(ADDLs)可刺激BV2小膠質(zhì)細胞發(fā)生形態(tài)學改變:細胞皺縮變圓，突觸縮短或消失，細胞多形性逐漸消失;抗Aβ1-42抗體中和細胞組雖能減緩細胞形態(tài)變化的速度但無法阻止形態(tài)變化的繼續(xù);
　　(2)激活組細胞上清中IL-1β濃度隨ADDLs作用時間的先上升后下降;抗體組IL-1β濃度隨時間先