多肽ELISA方法建立及其在肝癌早期診斷相關研究中的初步應用.pdf

1、肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,也是世界上各種實體腫瘤中預后效果較差的惡性腫瘤之一,并具有與乙肝、肝硬化等密切聯(lián)系的疾病特點。因此,癌癥的早期預警技術研究對于預防肝癌、預測肝癌的發(fā)病趨勢具有非常重要的研究價值和社會意義。目前臨床上廣泛應用的肝癌診斷標志物 AFP,對于腫瘤直徑小于3cm的肝癌患者其敏感性、特異性均不理想。近幾年,國際上許多研究人員發(fā)現血清中豐富的多肽資源可以扮演腫瘤標志物這個重要角色,對于腫瘤的早期預警、早期診斷具有重

2、要的研究意義。其中,有報道稱多肽Pep5是潛在的腫瘤診斷標志物之一。本論文建立了檢測多肽標志物Pep5的ELISA方法,同時應用于肝癌患者的檢測分析,評價其診斷肝癌的價值與臨床意義。
　　首先采用傳統(tǒng)的單克隆抗體制備方法成功建立針對Pep5的3株雜交瘤細胞株,即2F6、4F6及7G7,上清抗體的靈敏度均達到10ng/ml。同時制備3種細胞株的腹水抗體,總計41ml,效價均在1:2000000以上。并進行純化與酶標,共得到純化抗體2

3、8ml,2F6及7F7滴度達0.5ng/ml,4F6為5ng/ml。3種高靈敏度、高特異性的抗體為后續(xù)方法建立奠定了基礎。
　　應用所制備的抗體,本文分別建立三種檢測Pep5的ELISA方法,即直接法、夾心法與競爭法,并分別進行關鍵條件的優(yōu)化。直接法優(yōu)化結果為HRP-2F6濃度1.25ug/ml,血清1:20稀釋;夾心法為7G7單抗1:2000包被,HRP-2F6濃度為5μg/ml,血清1:10稀釋;競爭法Pep抗原0.5ng包被

4、,HRP-2F6為1:20000稀釋,血清1:5稀釋。使用三種方法分別驗證小量樣本,其中直接法區(qū)分肝癌與正常組效果最好(P<10-6),敏感性93.3％,特異性83.3%。
　　本文分別對優(yōu)化后的直接ELISA方法的線性范圍、檢測限、精密性、回收率進行評價。其中在1.5-20ng/ml范圍內線性關系良好,檢測限為1.24ng/ml,相關系數為0.9959。分別取9、12、15ng/ml合成多肽進行檢測,得到批內與批間CV為1.44

5、%-6.17%,日內與日間CV為2.89%-4.89%,回收率分別為98.98%,99.61%,101.58%。評價結果表明,優(yōu)化后的直接ELISA法適用于血清中多肽的檢測。
　　最后采用直接 ELISA法檢測420例臨床血清,正常組與肝癌組差異顯著(P<0.001)。當Pep5的診斷閾值為7.48ng/ml時,診斷肝癌的敏感性為80.8%,特異性為96.2%。經檢測94例肝癌血清時,Pep5的檢出率(90.4%)高于AFP(63