弓形蟲病PCR和ELISA診斷方法的建立和初步應(yīng)用.pdf

1、弓形蟲是細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，能感染大多數(shù)哺乳動物。弓形蟲感染畜禽，可使妊娠家畜受到嚴(yán)重威脅，尤其給豬、牛、羊飼養(yǎng)業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于臨床上弓形蟲病缺乏特異性臨床癥狀和體征，診斷仍是弓形蟲病防治中一個突出的問題。目前，臨床上常用、也是目前我國衛(wèi)生部門推薦的，還是血清學(xué)檢測方法。但其仍存在一些問題，如出現(xiàn)交叉反應(yīng)，又多受機(jī)體免疫狀態(tài)以及方法本身敏感性和特異性的影響，容易出現(xiàn)誤診和漏診。同國外的一些試劑盒相比，目前我國還缺少令人滿意的試劑盒。

2、診斷試劑盒中存在的一個主要問題是包被抗原的純度或抗原活性不夠，導(dǎo)致檢出的準(zhǔn)確率不高，為此，我們探討利用SAGⅠ體外表達(dá)產(chǎn)物作為抗原建立弓形蟲ELISA診斷試劑盒的可行性，并進(jìn)行了臨床上應(yīng)用，取得了較好的結(jié)果。同時本研究還建立了弓形蟲的PCR診斷方法，并初步應(yīng)用于臨床檢測。 1.弓形蟲聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)方法的建立和初步應(yīng)用：通過對弓形蟲各種抗原性的比較，選擇SAGⅠ基因中比較保守的一段序列設(shè)計(jì)了一對引物，擴(kuò)增出長度為270bp

3、的片段，建立了檢測弓形蟲病的PCR診斷方法，并對該方法的靈敏性和特異性進(jìn)行了研究：將蟲體個數(shù)計(jì)數(shù)后提取模板DNA進(jìn)行PCR，結(jié)果表明當(dāng)稀釋到相當(dāng)于0.85個蟲體的DNA量時結(jié)果還是陽性。對臨床上幾種流行豬病和兩種寄生蟲病的病料進(jìn)行檢測，結(jié)果都沒有擴(kuò)增出目標(biāo)片段，上述結(jié)果表明，該方法敏感性高、特異性強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上對送檢的85份抗凝血樣進(jìn)行了檢測，其中檢出陽性34份，陽性率為40％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，弓形蟲PCR診斷方法是臨床檢測弓形蟲病的一種

4、行之有效的方法。 2.弓形蟲SAGⅠ基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)產(chǎn)物抗原性的分析根據(jù)Genebank上公布的弓形蟲SAGⅠ的序列設(shè)計(jì)合成引物，PCR擴(kuò)增和克隆了SAGⅠ基因主要表面抗原部分編碼區(qū)段，并測定了核苷酸序列?？寺〉腟AGⅠ基因長度為978bp。進(jìn)一步將此片段亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX-KG，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，Western-blot印跡檢測獲得了分子量為56KD的與谷胱苷肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)相融合的表達(dá)蛋白，具

5、有抗原性。這為下一步大規(guī)模獲取SAGⅠ進(jìn)行疫苗研究和診斷試劑的開發(fā)提供了條件。 3.弓形蟲主要表面抗原性基因SAGⅠ基因表達(dá)蛋白ELISA方法的建立和初步應(yīng)用利用在大腸桿菌中最佳的表達(dá)條件下體外表達(dá)了弓形蟲主要膜表面抗原SAGⅠ基因，提取、純化表達(dá)蛋白形成的包涵體，用提純的包涵體包被ELISA板來檢測抗弓形蟲抗體，建立了弓形蟲SAGⅠ蛋白的ELISA診斷方法。用該方法對豬的幾種其它傳染病做了檢測，檢測結(jié)果均為陰性；隨機(jī)抽取了5份