豬圓環(huán)病毒病的病原比較診斷及血清抗體間接ELISA診斷方法的建立和初步應(yīng)用.pdf

1、目的：(1)比較豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)的病原診斷方法。(2)建立PCV2血清抗體的間接ELISA方法。方法：(1)將14份PCR檢測(cè)為PCV2陽(yáng)性的病料，經(jīng)過常規(guī)處理后接種于PK-15細(xì)胞，盲傳3代后，應(yīng)用本室已建立的PCR方法將第3代細(xì)胞毒擴(kuò)增鑒定。同時(shí)，應(yīng)用D(+)-氨基葡萄糖處理至第5代，測(cè)定D(+)-氨基葡萄糖處理對(duì)PCV2病毒分離和傳代的影響.(2)通過比較差速離心、蔗糖不連續(xù)梯度離心、氯化銫等密度梯度離心和氯仿抽提結(jié)合

2、超速離心等四種方法純化PCV2抗原的包被效果，以確定最佳的PCV2包被抗原純化方法。在此基礎(chǔ)上，通過全病毒抗原最適包被濃度和二抗HRP-SPA濃度的確定，待測(cè)血清稀釋度，封閉液的確定，封閉時(shí)間的確定，HRP-SPA反應(yīng)時(shí)間的確定，臨界值的確定，特異性測(cè)定，重復(fù)性測(cè)定等建立并進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)PCV2抗體的間接ELISA方法。結(jié)果：(1)14份PCR檢測(cè)PCV2陽(yáng)性的病料，接種于PK-15細(xì)胞，盲傳3代后分離到6株P(guān)CV2，病毒分離陽(yáng)性率為4

3、2.83％(6/14)，同時(shí)應(yīng)用本室建立的PCR方法重復(fù)對(duì)14份PCV2陽(yáng)性病料擴(kuò)增均仍為陽(yáng)性。(2)將盲傳3代后分離到的6株P(guān)CV2繼續(xù)傳代至第5代，D(+)-氨基葡萄糖處理組有4株陽(yáng)性(4/6)，未處理組僅有1株陽(yáng)性(1/6)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)處理組PCR擴(kuò)增條帶明顯比未處理組亮.(3)氟仿抽提結(jié)合超速離心純化PCV2抗原的包被效果最佳，氯化銫密度離心次之.(4)用氯仿抽提結(jié)合超速離心的方法純化的PCV2包被抗原的最佳濃度為1μg/孔/10

4、0μL.，待測(cè)血清稀釋度1：80，二抗HRP-SPA的最佳工作濃度為1：30000。優(yōu)化建立的檢測(cè)PCV2抗體的間接ELISA方法與CSFV、PRV和PRRSV的陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較好的特異性.該法與進(jìn)口PCV2-ELISA試劑盒(IDXXX產(chǎn)品)比較，陽(yáng)性符合率為92.86％(13/14)、陰性符合率為87.1％(27/31)、總符合率為88.89％(40/45)。(5)應(yīng)用該方法，檢測(cè)了福州，南平，三明，漳州，莆田等地市1

5、7個(gè)豬場(chǎng)309份血清，PCV2抗體陽(yáng)性率為29.13％(90/309)。結(jié)論：(1)與病毒分離法比較，木室建立PCV2的PCE技術(shù)具有快速、重復(fù)性好、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，可用于PCV2的病原診斷。(2)D(+)-氨基葡萄糖處理接毒細(xì)胞可以促進(jìn)病毒的增殖，提高PCV2含量和病毒分離的陽(yáng)性率。(3)氯仿抽提結(jié)合超速離心是PCV2抗原純化的最佳方法。(4)優(yōu)化建立的檢測(cè)PCV2抗體的間接ELISA方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性高，穩(wěn)定性好可用于PCV2血清