豬圓環(huán)病毒PCR診斷方法建立及標(biāo)準(zhǔn)制訂.pdf

1、豬2型圓環(huán)病毒(Porcine circovirus 2，PCV2)與近年來世界各國普遍發(fā)生的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)密切相關(guān)，該病主要以進行性消瘦和多系統(tǒng)病理損傷為特征，更為嚴(yán)重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各種病原的繼發(fā)感染，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。本研究建立了檢測與診斷豬圓環(huán)病毒的PCR方法及同時檢測PCV2

2、、PPV和PRV的多重PCR方法。并應(yīng)用此方法對河南省某大型豬場不同類型豬群疑似PCV2進行檢測，旨在為PCV2的流行病學(xué)、疫病預(yù)防等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供依據(jù)。主要內(nèi)容及結(jié)果如下： (一)根據(jù)已報道的PCV2基因組序列，設(shè)計并合成了3對寡核苷酸引物，通過優(yōu)化PCR的條件，成功地從PCV2感染的細胞中擴增出487bp片段，回收PCR產(chǎn)物測序，并用EcoR Ⅰ進行酶切，得到301 bp、186 bp的兩條帶，與預(yù)期的結(jié)果相符合，證實了

3、該擴增片段的特異性，并對PRV DNA、PPV DNA和正常PK-15細胞基因組DNA的PCR擴增均為陰性，證明了PCR檢測方法的特異性，PCR檢測PCV2 DNA的最小量為0.1 pg。 (二)在建立的PCV2和豬偽狂犬病毒(PRV)的單相PCR基礎(chǔ)上，通過對擴增條件的篩選，最終成功地建立了PCV2和PRV的復(fù)合PCR診斷方法，即利用一次PCR反應(yīng)，可同時擴增PCV2的487 bp和PRV的355 bp特異性片段，而擴增相應(yīng)的

4、培養(yǎng)細胞(PK15)核酸結(jié)果均為陰性，對PCV2和PRV的最低檢出量分別為100 pg和10 pg的DNA。該方法適合對PCV2和PRV的聯(lián)合檢測和鑒別診斷。 (三)建立一種同時檢測PCV2、PPV和PRV的多重PCR方法。根據(jù)GenBank上發(fā)表的PCV2、PPV和PRV基因序列，針對各自保守區(qū)各設(shè)一對特異性引物，用這3對引物對同一樣品中的PCV2、PPV和PRV進行檢測，對其它幾種病原的PCR擴增結(jié)果均為陰性；敏感性測定結(jié)果