豬傳染性胸膜肺炎ELISA診斷方法的建立及初步應用.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contagious pleuropneumonia)的致病菌,該病是一種呼吸道疾病,影響著全世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展.豬感染此病后會呈現(xiàn)從急性的突然死亡到慢性感染及亞臨床感染等癥狀.急性感染可表現(xiàn)為肺的纖維素性、出血性壞死,死亡率高;慢性感染的豬無明顯的臨床癥狀但生長緩慢.發(fā)病后存活下來的豬可成為病原的攜帶者,從而可能

2、引起此病的再次爆發(fā).所以,豬群APP血清抗體的檢測對預防和控制該病的爆發(fā)具有十分重要的意義.迄今為止,已報道的APP血清型共有15種,不同血清型之間沒有或僅有弱的交叉反應,這給該病的診斷和預防帶來了很大的困難.傳統(tǒng)的血清學診斷方法,如CFT、IHA等,針對的是菌體抗原誘導產生的抗體,只能對同血清型的APP做出檢測.免疫預防也存在著同樣的問題,APP的滅活苗具有一定的保護力,但是,也只能對同血清型APP的感染產生保護.該研究主要是針對以上

3、情況,旨在建立一種特異、敏感、能對所有血清型APP做出檢測的血清學檢測方法.由于胸膜肺炎放線桿菌的毒素和轉鐵結合蛋白具有種特異性,所以有希望用于APP診斷方法的建立.將含有豬胸膜肺炎放線桿菌毒素Ⅱ基因的質粒pET-Apx Ⅱ轉化到大腸桿菌BL21(DE3).挑選出表達量最高的克隆子,然后于37℃經IPTG誘導表達.對表達條件進行優(yōu)化,并對包涵體進行了變性和復性.用復性后的蛋白作抗原,建立了檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗體的間接酶聯(lián)免疫吸

4、附試驗(ELISA).與間接血凝(IHA)檢測結果作了比較,證明所建立的ELISA診斷方法具有較高的特異性和敏感性,并具有良好的穩(wěn)定性和可重復性.利用建立的Apx Ⅱ-ELISA診斷方法對2503份臨床送檢的各地豬血清進行檢測,測得豬傳染性胸膜肺炎的陽性率平均為63﹪以上.利用地方分離的APP血清型2型菌株,設計一對引物,用PCR的方法擴增了其轉鐵結合蛋白A基因(tbpA基因),擴增片段的大小為2726bp,并克隆到pET-28b中構建