雙抗體夾心ABC--ELISA和膠體金免疫層析試紙條檢測弓形蟲循環(huán)抗原方法的建立.pdf

1、弓形蟲是一種專性細胞內寄生的寄生蟲，宿主范圍廣泛，可寄生于哺乳動物、鳥類及一些冷血動物，呈世界范圍內流行，全球約有10億人感染，我國人群感染率為7.88％。畜禽血清陽性率很高，豬弓形蟲陽性率高達30.16％，弓形蟲感染嚴重影響了人的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。弓形蟲是一種機會致病原蟲，人感染后多數無明顯特異性癥狀表現(xiàn)，但急性感染發(fā)生于孕婦、初生兒或免疫抑制患者就會產生嚴重的后果，因此對弓形蟲病的早期診斷和盡早治療具有重要意義。弓形蟲循環(huán)抗原(c

2、irculating antigen，CAg)是弓形蟲感染過程中出現(xiàn)最早的特異性標志物，通過檢測血清弓形蟲循環(huán)抗原可以實現(xiàn)對弓形蟲急性感染的早期或活動期的檢測，本研究建立了雙抗體夾心ABC-ELISA和膠體金免疫層析試紙條兩種方法，來檢測弓形蟲循環(huán)抗原，以實現(xiàn)弓形蟲感染的早期診斷，對目前通過抗體檢測弓形蟲的方法是一種有效的補充。
　　試驗1抗CAg單抗的制備及抗ESA多抗的制備
　　弓形蟲循環(huán)抗原(CAg)是弓形蟲早期感染的

3、重要指標，制備抗CAg的高特異性抗體，對于建立弓形蟲感染的早期診斷方法具有重要意義。制備了弓形蟲排泄分泌抗原（excretory-secretory antigens，ESA），并將其免疫動物，融合后的雜交瘤細胞先通過兩種ESA抗原的篩選，再經含CAg的陽性血清篩選，以獲得特異性針對CAg的單抗，并對所獲單抗的性質進行鑒定。結果表明，獲得了3A5、3E5和10F5-3三株單抗，其效價分別為1∶64000、1∶32000、1∶32000，

4、三株單抗分別針對不同的抗原表位，免疫熒光定位顯示三株抗體均與弓形蟲反應，表明獲得的三株單抗對弓形蟲CAg都有較高的特異性，均可應用于對弓形蟲感染早期或活動期的診斷。
　　試驗2雙抗夾心ABC-ELISA方法的建立
　　為檢測弓形蟲循環(huán)抗原，以實現(xiàn)弓形蟲急性感染的早期診斷，建立了基于ABC(avidin biotin-peroxidase complex)放大系統(tǒng)的雙抗體夾心ELISA方法。以方陣滴定法確定多抗最佳包被量和單抗

5、工作濃度，利用夾心法和ABC放大系統(tǒng)建立了檢測弓形蟲循環(huán)抗原的夾心ABC-ELISA方法，用該方法對人工感染犬和陽性感染血清進行檢測以確定該方法的檢出時間和準確性，并應用于臨床樣本的檢測。結果表明，雙抗體夾心ELISA反應條件:兔多抗包被濃度為3.7μg/mL，生物素標記3A5、3E5和10F5-3單抗在混合工作液中的濃度分別為0.1μg/mL、0.13μg/mL、0.12μg/mL，酶標生物素和鏈酶親和素以2∶3體積比混合成ABC復合

6、物。該ELISA方法的對ESA最低檢測限為11.9 ng/mL，并與隱孢子蟲早期感染牛血清、血吸蟲尾蚴早期感染牛血清、艾美耳球蟲早期感染雞血清、犬瘟熱急性感染早期血清、犬細小急性感染血清無交叉反應。用該ELISA方法檢測人工感染的犬，于感染后2d血清即顯示陽性，本方法能明顯區(qū)分標準陽性血清和陰性血清。68份豬臨床血樣（混入2份標準陽性血清）用該方法和Nest PCR同時檢測結果一致。表明該雙抗體夾心ABC-ELISA方法特異性強、靈敏性

7、高，可用于弓形蟲急性感染的早期、或活動期的快速診斷。
　　試驗3膠體盒免疫層析試紙條的研制
　　為建立一種簡易、快速的膠體金免疫層析法(colloidal gold immunochromatography test，ICT)用于檢測血清中弓形蟲循環(huán)抗原(CAg)。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，用膠體金顆粒標記抗CAg單克隆抗體，抗ESA兔多抗噴涂于NC膜，建立了基于雙抗夾心法的免疫層析檢測方法，血清中的弓形蟲循環(huán)抗原

8、與金標記單克隆抗體結合后沿著硝酸纖維素膜移動，與膜上的固相多克隆抗體結合形成肉眼可見的紅色線條。用該方法對感染后不同時間犬陽性血清進行檢測，并對已知弓形蟲感染陰性和陽性血清進行檢測以確定其準確性，與雙抗體夾心ABC-ELISA進行比較。結果表明，使用該試紙條檢測弓形蟲感染犬血清，感染后2～7 d的血清均為陽性，表明該方法適用于弓形蟲感染的早期診斷，并與隱孢子蟲早期感染牛血清、血吸蟲尾蚴早期感染牛血清、艾美耳球蟲早期感染雞血清、犬瘟熱急性