氣腫疽梭菌Dot-ELISA方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、氣腫疽梭菌（Closridiumchauvoei）是一種產(chǎn)芽孢的梭狀桿菌，產(chǎn)生的芽孢可長(zhǎng)期存活在土壤中，經(jīng)消化道或粘膜侵入機(jī)體，引起惡性水腫和氣性壞疽等癥狀，具有傳染性，可以感染人。針對(duì)該病的診斷尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)。因此，本研究旨在以制備的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為抗體建立一種快速、簡(jiǎn)便而且靈敏的血清學(xué)診斷方法，為日后氣腫疽診斷制劑的研制奠定理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。
　　本試驗(yàn)成功的純化了由氣腫疽梭菌標(biāo)準(zhǔn)株 C54-1的提取的有效抗原，以特異性

2、最強(qiáng)的純化抗原免疫豚鼠，經(jīng)四次免疫后獲得的血清以1000倍稀釋后，用ELISA法檢測(cè)其 OD450nm值達(dá)1.6以上，并經(jīng) Dot-ELISA方法重復(fù)性試驗(yàn)研究表明，該血清特異性和穩(wěn)定性?xún)?yōu)良，可作為氣腫疽梭菌雙抗體夾心Dot-ELISA方法的一抗用于檢測(cè)。
　　篩選最適反應(yīng)條件是Dot-ELISA試驗(yàn)的重點(diǎn)。通過(guò)反復(fù)優(yōu)化，確定抗體最佳稀釋度為1:1024；可檢測(cè)到最低菌體抗原量為3.125μg，最低分泌抗原量為1.89μg；最適酶

3、標(biāo)二抗?jié)舛葹?:4000。采用雙抗體夾心 Dot-ELISA方法、AGID法和 PCR法同時(shí)檢測(cè)30只致病豚鼠肝臟和脾臟碾磨液，結(jié)果 Dot–ELISA方法與PCR法陽(yáng)性符合率為93.3％，陽(yáng)性檢出率是 AGID法的2.5倍，表明該方法靈敏度很高。用試驗(yàn)建立的雙抗體夾心Dot-ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室已確診病料，30份陽(yáng)性樣本中檢出26份陽(yáng)性結(jié)果，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 AGID法的檢出率，證明該方法準(zhǔn)確性較高。
　　本試驗(yàn)是國(guó)內(nèi)首次應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)株氣腫