鴨IgY的穩(wěn)定性研究及檢測鴨肝炎抗體Dot-ELISA的建立.pdf

1、鴨卵黃免疫球蛋白IgY作為一種特異性抗體，既具有哺乳類IgG的生物活性，又具有許多較哺乳類IgG更為優(yōu)越的特點(diǎn)。在我國，鴨病毒性肝炎是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一。本文主要通過對鴨肝炎病毒的分離，純化，免疫種鴨獲得抗鴨肝炎病毒卵黃抗體，并對其分離純化條件進(jìn)行探索和對IgY某些穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)研究，建立了檢測鴨肝炎抗體的Dot-ELISA方法。獲得如下結(jié)果： 1.抗鴨肝炎病毒卵黃抗體的制備 1.1采用標(biāo)準(zhǔn)DHV-Ⅰ毒株(ATC

2、C株)，接種鴨胚增殖病毒，氯仿抽提，PEG濃縮，差速離心得到較純的鴨肝炎抗原(濃縮50倍)。蛋白含量為18.75mg/ml，能用于種鴨的免疫和酶標(biāo)板的包被。1.2通過乳化鴨肝炎病毒，經(jīng)安全檢驗(yàn)制備的鴨肝炎疫苗，按免疫程序進(jìn)行種鴨免疫，兩個(gè)月后測定血清抗體活性達(dá)到1∶128時(shí)，拾取種蛋，以為后續(xù)研究提供材料。 2.采用水稀釋法制備鴨卵黃水溶液，對水稀釋法的幾種條件進(jìn)行優(yōu)化 2.1確定pH5.1是從稀釋鴨卵黃液里分離抗體的最

3、適pH，低于pH5.1時(shí)會(huì)引起抗體溶解度的下降，高于pH5.1時(shí)則不利于脂質(zhì)的沉淀。 2.2確定1∶10為稀釋鴨卵黃液的最佳稀釋倍數(shù)。在制備鴨卵黃水溶液的過程中，隨著稀釋倍數(shù)的增加，離心上清液中蛋白質(zhì)含量逐漸上升，而脂肪的含量則呈下降趨勢，當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到1∶10后，上清液中的蛋白質(zhì)含量和脂肪含量基本趨于一致。 2.3確定稀釋后的鴨卵黃水溶液至少應(yīng)放置6小時(shí)，上清液的澄清度較好，脂蛋白的沉積量達(dá)到最大；增長放置時(shí)間，上清液

4、沒有明顯變化。 3.抗鴨肝炎病毒卵黃抗體的分離純化 3.1通過兩種鹽析方法的比較，確定辛酸—硫酸銨法為比較適合鴨卵黃抗體的粗提方法。 3.2通過離子交換層析，凝膠過濾層析將鴨的完整型IgY和缺失型IgY(△Fc)成功分開，確定離子交換層析時(shí)用0.02mol/LTris-HCl緩沖液平衡，洗脫時(shí)流速為1.0ml/min；凝膠過濾層析時(shí)用0.02mol/LPBS平衡，洗脫時(shí)流速為0.1ml/min。 4.高純

5、度抗鴨肝炎病毒卵黃抗體間接ELISA試驗(yàn)條件的優(yōu)化 4.1確定鴨肝炎抗原濃度定為16μg/ml：當(dāng)抗原濃度為4μe/ml時(shí)，檢測OD值已達(dá)到0.519,當(dāng)濃度達(dá)16μg/ml時(shí)，己穩(wěn)定在ELISA檢測峰值。 4.2確定一抗(抗鴨肝炎病毒卵黃抗體)濃度定為28μg/ml：當(dāng)一抗?jié)舛戎饾u增加時(shí)，OD值從增加到趨向穩(wěn)定，在2μg/ml到25μg/ml的濃度范圍內(nèi)，OD值隨一抗?jié)舛鹊脑黾映示€性增加，在16μg/ml到32μg/m

6、l的濃度范圍內(nèi)，OD值隨一抗?jié)舛鹊脑黾由杂性黾樱瑵舛仍?2μg/ml以上，OD值趨于穩(wěn)定，本試驗(yàn)選擇一抗用量為28ug/ml。 4.3確定酶標(biāo)羊抗鴨lgG的稀釋度為1∶3200。隨著酶標(biāo)羊抗鴨gG稀釋倍數(shù)的增加，OD值逐漸下降，尤以3200倍稀釋度到6400倍稀釋度時(shí)下降最為明顯。所以，從節(jié)約酶標(biāo)抗體和試驗(yàn)檢測水平所需的最低酶標(biāo)抗體量出發(fā)，選擇酶標(biāo)抗體的稀釋度為1∶3200。 5.高純度抗鴨肝炎病毒卵黃抗體在幾種條件下的

7、穩(wěn)定性試驗(yàn) 5.1處理溫度在65℃時(shí)，抗鴨肝炎病毒卵黃抗體活性保留率保持在97﹪左右，抗體活性變化不大，在70℃處理時(shí)，抗體活性保留率下降到85﹪左右，抗體活性有較微弱的降低；而當(dāng)溫度等于或高于75℃時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長，在75℃時(shí)，抗體活性保留率下降到35﹪，而在80℃時(shí)，抗體活性保留率下降到19﹪，抗體活性大幅度下降。 5.2處理溫度在75℃時(shí)，處理時(shí)間為30min時(shí)，抗鴨肝炎病毒卵黃抗體的原液抗體活性保留率下降到

8、38﹪左右，而其稀釋液的抗體活性保留率下降到32﹪左右，隨著抗鴨肝炎病毒卵黃抗體濃度的降低，抗體活性下降速度明顯增大。 5.3抗鴨肝炎病毒卵黃抗體在堿性、中性和弱酸性pH范圍內(nèi)(pH4～12)都能保持較好的穩(wěn)定性，而在強(qiáng)酸性范圍內(nèi)(如pH3)，抗體活性損失較大，處理時(shí)間達(dá)到8h時(shí)，抗體活性喪失約73﹪，并隨著在強(qiáng)酸性條件下(如pH3)放置時(shí)間的延長，活性先快速下降，到6h左右，抗體活性保留率降到31﹪，而到8h左右，抗體活性保留

9、率降到27﹪，基本保持穩(wěn)定狀態(tài)。 5.4在pH值為2的環(huán)境下，處理時(shí)間在1h時(shí)，抗體活性己降到18﹪，處理時(shí)間達(dá)到2h時(shí)，抗鴨肝炎病毒卵黃抗體已完全失活；說明短時(shí)間的胃蛋白酶處理就能使鴨卵黃抗體完全失活；而pH值達(dá)到4時(shí)抗體失活速度相對較慢。處理時(shí)間達(dá)到4h時(shí)，抗鴨肝炎病毒卵黃抗體活性保留率才下降到79﹪。 5.5當(dāng)環(huán)境的pH為8.0時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長，到8h左右時(shí)，抗體活性保留率還有50﹪，并且抗體活性下降速度比較

10、遲緩，就影響程度而言，比pH2下用胃蛋白酶處理要弱很多，與在pH4下用胃蛋白酶的變化相似。 6.建立檢測鴨肝炎抗體的Dot-ELISA方法 6.1確定樣品稀釋液為含0.5﹪BSA的PBS-T(含0.05﹪Tween-20)稀釋血清和酶標(biāo)抗體效果最好，能進(jìn)一步消除非特異性反應(yīng)。 6.2確定洗滌液為0.01MPH7.4PBS-T(含0.05﹪Tween-20)作洗滌液，DOT-ELISA效果最好。6.3確定血清稀釋倍